基于轉錄組探究Enterococcus faecium 15A降解二乙基亞硝胺的作用機制

鐘雨婷，張倩，姚姝婷，羅婭，明悅，李曉玲，劉璇，岳鑫，魏香奕，劉剛，李學理，3*

（1.成都醫學院檢驗醫學院，四川 成都 610500；2.四川師范大學生命科學學院，四川 成都 610000；3.成都醫學院四川省動物源性食品獸藥殘留防控技術工程實驗室，四川 成都 610500）

二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）早在1987年就被世界衛生組織（World Health Organization，WHO）國際癌癥研究署（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為 2A 致癌物[1]，一次大劑量攝入或長期少量積累均可能引發癌癥[2]。研究證實，NDEA廣泛分布于水、環境、發酵食品及人體消化道，主要誘發肝臟組織病變和腫瘤[2-3]。因此，開展安全、高效降解NDEA相關研究迫在眉睫。

微生物降解法因具有高效、安全、經濟等優勢而成為目前降解NDEA的研究熱點，其中備受關注的是乳酸菌。因為乳酸菌是食品中常用的發酵劑，同時也具有改善腸道蠕動、緩解便秘、治療腹瀉、抑制腸道致病菌等益生功能，可降解NDEA的乳酸菌不僅能豐富發酵食品風味、延長貨架期、促進營養吸收、維持腸道微生態平衡，還能減除NDEA、降低患癌風險[4-5]。

目前，微生物降解NDEA研究偏重從發酵食品、人體腸道中分離和篩選乳酸菌，評價其降解能力。如Nowak等[6]發現3株來源于人體腸道的乳酸菌能有效降解NDEA。項目組前期獲得1株來源于健康人腸道的糞腸球菌（Enterococcus faecium，E.faecium）15A，能有效降解NDEA[7]。E.faecium是哺乳動物腸道中重要的原籍乳酸菌[8]，應用于肉制品發酵和益生菌劑的制備，具有改善肉品感官品質、調節腸道菌群結構、提高機體免疫力等功能[9]。

然而，乳酸菌降解NDEA的機理研究較少，降解作用的關鍵基因、調控蛋白、代謝通路等分子機制更未闡明。這勢必限制乳酸菌作為發酵劑、益生菌在食品產業中的開發與應用。因此，本研究首先系統考察了不同環境中E.faecium 15A對NDEA的作用特性，基于作用特性結果，采用轉錄組學分析了菌株降解的差異表達基因、代謝途徑，利用實時反轉錄聚合酶鏈式反應（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術驗證關鍵的差異表達基因，從分子層面探究E.faecium 15A降解NDEA的機制，為利用E.faecium 15A有效清除NDEA提供支持。將E.faecium 15A制成菌劑和發酵劑，形成更安全的發酵乳、發酵肉、益生菌等產品，為減輕NDEA致癌性開辟新的膳食方案。研究結果可拓展乳酸菌的益生功能，開發具有更高保健價值的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種及試劑

二乙基亞硝胺（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；酵母粉：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；牛肉膏：北京路橋技術有限公司；葡萄糖、檸檬酸三銨、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；甲醇（色譜純）：上海易恩化學技術有限公司。試驗菌株由四川師范大學生命科學學院微生物實驗室提供的健康人體腸道乳酸菌中分離純化和篩選所得，經測序鑒定，最終確定為E.faecium 15A。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機（Centrifuge 5804R）：德國艾本德公司；全自動高壓滅菌鍋（GI-54DWS）：上海巴玖實業有限公司；數顯式臺式酸度計（雷磁PHSJ-4F）：上海儀電科學儀器股份有限公司；高效液相色譜儀（Agilent1200）：美國安捷倫科技公司；紫外分光光度計（UV1102）：上海天美科學儀器有限公司；電熱恒溫培養箱（HPX-9272MBE）：上海博迅實業有限公司；恒溫振蕩器（THZ-312）：上海精宏實驗設備有限公司；超純水機（Ⅱ-5/10T）：四川優普超純科技有限公司。

1.3 液體培養基的配制

液體培養基：4.0 g酵母粉、5.0 g牛肉粉、20.0 g葡萄糖、2.0 g檸檬酸三銨、5.0 g乙酸鈉、2.0 g磷酸氫二鉀、0.2 g硫酸鎂、0.05 g硫酸錳、1.0 mL吐溫80，用蒸餾水定容至1 L，pH值為6.0、121℃滅菌15 min～20 min。

1.4 NDEA的檢測

參考姜慧萍[10]檢測NDEA方法，并做一定修改。采用高效液相色譜法進行試驗，色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、檢測器為二極管陣列檢測器、檢測器波長230 nm、流動相為甲醇∶水（體積比）=35∶65、流速0.8 mL/min，取1 mL待測樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾得濾液待檢。

1.5 環境因素對降解作用的影響

E.faecium 15A培養12h，離心后用無菌生理鹽水制得菌懸液（107cfu/mL）。將菌懸液接種于含4.75 μg/mL NDEA的液體培養基中，對照組用等體積無菌生理鹽水代替菌懸液。37 ℃分別培養 3、6、9 、12、24、48 h，取樣，考察培養時間的影響；分別于 4、20、37、42 ℃的恒溫培養箱中培養24 h，考察溫度的影響；分別于培養基 pH 值為 2、3、4、5、6、7、8 的 37 ℃環境中培養24 h，考察pH值的影響；分別于37℃的恒溫培養箱及恒溫厭氧培養箱中培養24 h。檢測樣品中NDEA降解率 [NDEA降解率/%=（對照組NDEA含量-處理組NDEA含量）/對照組NDEA含量×100]，以及微生物的生長量（OD600）。

1.6 轉錄組分析

將制備好的E.faecium 15A菌懸液分別加入含4.75 μg/mL NDEA（處理組）和空白（對照組）的培養基中，在pH6、37℃、有氧條件下培養12 h，每組3個生物學重復。進行RNA的提取及質量檢測、文庫構建、通過Illumina HiSeq測序平臺對文庫進行測序的轉錄組分析。

1.6.1 差異基因分析及功能注釋

基于負二項分布，對樣品進行差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選[11]，閾值為 p＜0.05和｜log2（fold change）｜＞1。｜log2（fold change）｜值越大，表示差異倍數越大，若基因的log2（fold change）＞0，則認為該DEGs上調，若log2（fold change）＜0，則認為該DEGs下調[12]。

1.6.2 DEGs的富集分析

采用 GOseq[13]軟件和 KOBAS（2.0）軟件[14]分別基于基因分類數據庫（gene ontology，GO）、京都基因和基因組數據庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對DEGs進行功能注釋和生物通路分類，確定顯著差異基因或蛋白行使的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

1.7 RT-qPCR驗證

根據轉錄組測序分析結果，選擇5個基因進行RT-qPCR驗證，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

將E.faecium 15A菌懸液分別加入含4.75 μg/mL NDEA和空白的培養基中，在pH6和pH8、37℃、有氧條件下培養12h，進行熒光定量檢測。PCR反應體系（20μL）：SYBR熒光定量PCRMix 5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR 反應程序：95 ℃3 min、95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、95 ℃ 10 s、40 循環；熔解曲線：以1℃/循環的速度升溫，60℃～95℃保持4 s。利用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。

1.8 數據處理與統計分析

結果均為3次或多次試驗的平均值，采用Origin－Pro 9.1進行數據分析和制圖，所列結果用平均值±標準差表示。轉錄組分析時使用的是Bowtie2、HTSeq、DEGSeq、DESeq、GOSeq、hmmscan、KOBAS 軟件，Adobe Illustrator進行圖片編輯處理。

2 結果與分析

2.1 E.faecium 15A降解NDEA的作用特性

為明確E.faecium 15A降解NDEA的特性，首先考察了培養溫度、培養時間、pH值等環境因素對菌株生長情況及降解NDEA作用的影響，結果如圖1所示。

從圖1可知，菌株降解NDEA的能力與其生長情況變化趨勢一致：圖1A展示了E.faecium 15A降解NDEA作用和菌株生長量隨培養時間的變化情況。可以看出，菌株在前12 h生長迅速，培養12 h～48 h生長量基本穩定；菌株的生長情況呈現出生長曲線的常規變化趨勢，即隨培養時間的延長，菌量先增加后趨于平穩。同樣，受試菌株對NDEA的降解量表現出先增加后趨于穩定的變化規律，此結果與受試菌株的生長趨勢一致。當E.faecium 15A培養12 h時，對NDEA的降解率為30.03%，隨后，該菌株的降解率變化不明顯。

由圖1B可知，E.faecium 15A降解作用和菌株生長情況隨溫度變化也呈現一致的規律：在4℃到37℃范圍內，菌株的生長量和對NDEA的降解率隨溫度升高而逐漸升高，37℃時降解率達到最大值；在42℃的生長量比37℃略有減少，對NDEA的降解作用也略有減弱。同樣，菌株在有氧條件下的生長情況優于厭氧培養，其對NDEA的降解作用比有氧環境中的作用更強（圖1C）。

環境的pH值對細菌的生長繁殖極為重要[15]。由圖1D可知，pH值的改變對受試菌株的生長繁殖影響較大。E.faecium 15A在pH2～pH7范圍內表現出降解NDEA作用，并且，降解作用和菌株生長情況變化一致，在pH6環境中，菌株生長量和降解能力最強。而在pH8環境中E.faecium 15A表現為促進NDEA形成，說明pH值因素能改變E.faecium 15A對NDEA的作用特性。

結果表明，E.faecium 15A降解NDEA的能力和其生長情況變化趨勢一致，推測菌株降解作用與其生長代謝密切相關；培養溫度、培養時間、需/厭氧培養條件的改變，會影響菌株的降解能力，不會轉變菌株對NDEA的作用特性。而E.faecium 15A在pH2～pH7的環境中表現出降解NDEA的能力，在pH8的條件下轉變為促進NDEA的產生，可能是菌株在pH8和其它pH值條件下產生了差異蛋白，兩者轉錄途徑不同。基于此，采用轉錄組技術研究降解能力最強的條件下（pH6、37 ℃、有氧、12 h、4.75 μg/mL NDEA）和對照組（0 μg/mL NDEA）E.faecium 15A的差異表達基因及轉錄途徑，探究降解作用的關鍵基因和代謝通路。

2.2 轉錄組學分析

2.2.1 轉錄組測序數據質量評估

用Illumina HiSeq平臺對試驗樣品進行轉錄組學測序。對原始測序數據進行堿基測序錯誤率、堿基含量分布的檢查，具體結果見表2。

表2 E.faecium 15A的轉錄組測序數據質量統計Table 2 Quality statistics of transcriptome sequencing data of E.faecium 15A

Q20和Q30分別指質量值大于20、30的堿基占總體堿基的百分比，若Q20大于等于90%，Q30大于等于80%，則認為測序數據質量可信。本次測序的堿基錯誤率小于0.1%，Q20和Q30值均大于90%，處理組和對照組的平均GC含量分別為40.42%和40.15%，各項參數都達到測序質量的要求。表明轉錄組測序數據數量和質量可信度較高，可進行后續的數據分析。

2.2.2 DEGs分析

比較降解能力最強的條件下（pH6、37℃、有氧、12 h、4.75 μg/mL NDEA）E.faecium 15A 和對照組（0 μg/mL NDEA）的 DEGs，結果如圖2所示。

由圖2可知，兩者共有271個DEGs，其中92個基因上調、179個基因下調。

2.2.3 GO富集分析

GO是國際基因功能分類標準體系，包括分子功能、生物過程和細胞組成3個部分，GO數據庫可以對DEGs進行功能分類和富集分析。以矯正后的p＜0.05為評判指標，篩選出GO富集最顯著的前30條通路進行作圖分析，結果見圖3。

由圖3可知，有機氮化合物代謝過程、小分子代謝過程、有機氮化合物生物合成過程、嘌呤-核苷酸物質合成/代謝通路的DEGs富集最顯著且數目較大，其DEGs數目分別是 63、47、44、145個。GO 富集最顯著的前30條通路中，以嘌呤-核苷酸物質合成/代謝的通路數量最多（圖3中13條紅色條帶）。

2.2.4 KEGG富集分析

KEGG數據庫可用于系統分析基因功能和基因組信息，幫助研究人員將基因與表達信息看作一個整體網絡進行分析研究，其結果可用散點圖表示。E.faecium 15A的DEGs基于KEGG數據庫分析的結果見圖4。

如圖4所示，表示富集程度的指標包括富集分數、q值及富集到此通路上的基因數量。其中，富集分數表示該通路中富集的DEGs數量與注釋基因數量的比值，比值越大表示富集程度越高；q值是校正后的p值，取值范圍為0～1，若數值越接近0，表示富集越顯著，由圖4中散點的顏色表示，顏色越接近紅色表示富集越顯著；散點的大小表示該通路中的DEGs數量，越大表示DEGs數量越多。綜合富集程度指標可知，DEGs主要富集在遺傳信息處理中的RNA聚合酶合成、能量代謝中的氧化磷酸化、細胞過程中的群體感應、代謝中的嘌呤代謝途徑中。

2.3 RT-qPCR驗證

轉錄組結果表明，E.faecium 15A對NDEA的降解過程是一個多基因靶點、涉及多代謝通路的過程，GO和KEGG分析結果均說明嘌呤合成/代謝通路可能為主要的作用靶點通路。基于｜log2（Fold Change）｜和p值、基因是否存在意義的篩選條件確定DEGs（hpt、xpt、Pyk、Ndk、guaA），并采用 RT-qPCR驗證轉錄組測序（ribonucleic acid-sequenceing，RNA-seq） 結果的準確性，結果如圖5所示。

由圖5可知，RT-qPCR檢測的差異基因的表達趨勢與 RNA-seq 結果一致：hpt、xpt、Pyk、Ndk 基因上調，基因guaA表現為下調。進一步對比E.faecium 15A在降解作用最強的條件（pH6）與pH8環境下（促進作用）的上述基因表達變化。結果表明，E.faecium 15A降解能力與嘌呤-核苷酸物質合成/代謝途徑相關的基因hpt、xpt、Pyk、Ndk、guaA 相關。

3 討論

目前研究認為，乳酸菌降解NDEA的能力與其生長代謝的強度呈正相關[9-10，15-18]。例如，Kim 等[16-17]先后從韓國泡菜中分離出能降解NDEA的清酒乳桿菌、植物乳桿菌和明串珠菌，發現乳酸菌對NDEA的降解能力與菌株生長情況密切相關。這與本文的試驗結果一致：處于生長對數期的E.faecium 15A對NDEA的降解作用最強，乳酸菌的降解能力可能與活菌的數量有關[9-13，15]。

溫度、培養時間、氧氣含量、pH值等環境因素影響菌株的生長情況、降解NDEA的能力，證實了乳酸菌降解NDEA能力主要與菌株生長情況正相關。E.faecium 15A在最適生長溫度37℃環境中，對NDEA的降解能力最強。菌株在4℃（食品貯存溫度）、20℃（室溫）、42℃生長量相對較少，因此，展現出相對較弱的降解作用。E.faecium 15A在有氧環境中生長情況、降解作用均強于厭氧環境（模擬發酵食品內部環境）。環境的pH值能改變E.faecium 15A對NDEA的作用特性，pH2、pH4、pH6、pH7 條件下，E.faecium 15A 發揮對NDEA的降解作用，而pH8環境中，E.faecium 15A表現為促進NDEA形成。這與課題組前期的發現一致：環境pH值對亞硝胺的產生影響最顯著[15]。因此，為探究E.faecium 15A降解NDEA的機制，本文基于轉錄組學探究E.faecium 15A降解能力最強的條件下（pH6、37℃、有氧、12h、4.75 μg/mL NDEA）的 DEGs，并采用RT-qPCR驗證。同時，利用RT-qPCR對比pH8環境下E.faecium15A發揮促進作用時的相關基因表達量，以期獲得菌株降解NDEA的轉錄途徑和關鍵基因。

KEGG分析表明，DEGs富集在遺傳信息處理中的RNA聚合酶、能量代謝中的氧化磷酸化、細胞過程中的群體感應、代謝中的嘌呤代謝途徑。GO分析結果說明，該菌株的DEGs聚類在有機氮化合物代謝過程、小分子代謝過程、有機氮化合物生物合成過程、嘌呤-核苷合成/代謝的生物過程通路。其中，嘌呤-核苷合成/代謝過程的通路數量和差異基因數最多，其DEGs為xpt、hpt、Pyk、Ndk 和 guaA。

xpt、是腸球菌的看家基因，其進化速率相對較慢，具有高保守性和分辨率，xpt、負責調控黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶的產生[18-19]；hpt與次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶有關，此酶是嘌呤回收途徑中的關鍵酶，能催化5-磷酸核糖基-α-1-焦磷酸酯向次黃嘌呤或鳥嘌呤的轉移，生成次黃嘌呤核苷酸（inosine monphosphate，IMP）或鳥嘌呤核苷酸（guanosine monophosphate，GMP）[20]。而guaA編碼谷氨酰胺轉移酶，在嘌呤核苷酸代謝途徑中促進黃嘌呤核苷酸（xanthosine monophosphate，XMP）轉化為GMP[21-22]。PyK編碼的丙酮酸激酶，可催化磷酸烯醇式丙酮酸轉化為腺嘌呤三核苷酸磷酸（adenosine triphosphate，ATP）和丙酮酸，是糖酵解過程中一個關鍵的限速酶，與ATP、GMP的生物合成有關，能將IMP轉化為ATP、腺嘌呤二核苷酸磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、鳥嘌呤三核苷酸磷酸（guanosine diphosphate，GTP）、鳥嘌呤二核苷酸磷酸（guanosine diphosphate，GDP）。Ndk與核苷二磷酸激酶密切相關，它是調節核酸代謝的重要激酶，催化ATP和核苷二磷酸（nucleoside diphosphate，NDP）之間磷酸基團的轉移，有NDP激酶活性、蛋白磷酸轉移酶活性，可以參與轉錄調控和信號轉導[23]。

上述基因都編碼酶的產生，這些酶很可能參與降解NDEA或者是降解NDEA的關鍵蛋白[6，21]。Nowak[6]推測，乳酸菌降解NDEA的作用主要依靠菌株生長產生的某種關鍵組分，其能與NDEA結合并使之降解。Xiao等[24-25]獲得具有降解亞硝胺作用的戊糖乳桿菌（Lactobacillus.pentosus）R3。比較 L.pentosus R3 全菌體、無細胞上清液、細胞碎片、胞內提取液各部分對NDEA的降解能力后，發現L.pentosus R3降解作用的關鍵組分位于細胞碎片懸液中，通過分離和質譜鑒定確定細胞碎片中的作用物質多為表層蛋白質。此蛋白可能就是位于細胞膜或細胞壁上的降解酶。

對比RT-qPCR結果發現E.faecium 15A在降解能力最強的pH6條件下，嘌呤合成/代謝途徑的相關基因xpt、Pyk、Ndk均上調，這些基因在菌株展現促進作用的環境（pH8）均下調。因此，推測這些基因參與編碼的嘌呤合成/代謝酶可能是E.faecium 15A發揮降解NDEA作用的酶，或者這些酶是降解作用的關鍵蛋白，其合成或代謝的嘌呤可能為降解作用關鍵蛋白合成的前體物。所以，嘌呤合成/代謝途徑可能為E.faecium 15A降解NDEA的主要作用通路。

4 結論

本研究考察了環境因素對E.faecium 15A降解NDEA作用特性的影響。菌株降解作用與其生長情況相關，兩者變化趨勢一致，說明降解作用和菌株生長相關。培養溫度、培養時間、需/厭氧培養條件的改變會影響菌株的降解能力，不會轉變菌株對NDEA的作用特性。不同pH值環境下，菌株可能表現為降解NDEA或促進NDEA生成的作用。這可能由于E.faecium 15A對NDEA的作用過程是一個多基因靶點、涉及多代謝通路的過程，其中嘌呤合成/代謝途徑或為主要作用靶點通路。經RT-qPCR與RNA-seq結果對比，獲得了與降解作用的相關基因（xpt、hpt、Pyk、Ndk、guaA）。研究結果從分子層面探究了E.faecium 15A降解NDEA的機制，為利用E.faecium 15A有效清除NDEA提供理論支持。