介質阻擋放電低溫等離子體對酪蛋白粉末結構及成膜性影響

王雅娟，劉琦，牟光慶，吳曉萌

（大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034）

近年來，隨著全球經濟的快速發展，人們的環保意識也越來越強烈，可食用包裝膜已成為代替不可降解包裝的重要材料。食品包裝膜是用來保護食品在運輸的過程免受外力的損壞，這些包裝膜大多是由蛋白質、脂類或是多糖制成[1]，其中酪蛋白制成的薄膜具有良好的理化特性，這是由于酪蛋白中含有較多的鈣離子和其他鹽離子[2]。但是大多數的蛋白質膜的水蒸氣透過率較差，這阻礙了其在食品包裝中的應用[3]。因此，學者采用了各種方法來提升蛋白膜的包裝特性，如：熱處理和紫外線誘導等[4]。

等離子體是除氣體、液體和固體以外，物質存在的第四種狀態。等離子體加工是對材料表面進行改性，以達到對表面進行處理的目的[5-6]。低溫等離子技術（cold plasma，CP）是一種非熱加工技術，無害且適用于處理膜來改變材料的物理性能，現已多被應用于食品工業中[7]。低溫等離子技術是電子從電場中獲得能量，通過碰撞將能量轉化為分子的內能和動能，獲得能量的分子被激發，與此同時，部分分子被電離，這些活化后的粒子相互碰撞從而引起一系列復雜的物理化學反應[8]。正如許多論文所報道的，低溫等離子技術被認為是一種潛在的技術，用以改變材料性能，如親水性、柔韌性、拉伸強度（tensile strength，TS）和水蒸氣滲透性（water vapor permeability，WVP）[9]。低溫等離子技術可以改變明膠基薄膜的表面粗糙度、極性基團濃度和親水性，但處理后薄膜的水蒸氣和氧氣滲透性等阻隔性能沒有顯著變化[10]。在乳清和麩質薄膜中，機械性能包括拉伸強度（TS）和斷裂伸長率（elongation at break，EAB）都得到了提高，但介質阻擋放電低溫等離子體（dielectric barrier discharge-cold plasma，DBD-CP）處理并沒有顯著改變這兩種蛋白質薄膜的屏障性能和溶解度[11]。

DBD-CP技術可以改變材料的基本性能[12]。前期研究表明DBD-CP可以通過改變酪蛋白膜的結構特性進而影響膜的包裝性能，這可能與酪蛋白膜被DBD-CP處理后影響膜中水分子遷移進而導致膜的晶體物質遷移，從而改變了酪蛋白的排列結構有關[3]。此外，研究表明DBD-CP可以改變牛奶蛋白質的結構，導致牛奶蛋白質膠束的粒徑減小，結構更加穩定[13]。因此，本文以DBD-CP處理酪蛋白粉末的電壓和時間為變量，采用DBD-CP技術對酪蛋白粉末進行改性，并對處理后的成膜性的變化進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白（＞80%）、甘油（＞99.0%）：Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

V-100D型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；TA-XTplus型質構儀：英國Stable Micro System公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋：上海精密實驗設備有限公司；Binder KBF720型恒溫恒濕箱：德國賓得有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥器：上海森信實驗儀器有限公司；PL303型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HJ-4A型數顯恒溫磁力攪拌器：常州智博瑞儀器制造有限公司；Dura12F型超純水系統：澤布拉儀器科技（上海）有限公司；DF-101s型加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限公司；VORTEX-GENIE2型旋渦混合器：美國Scientific Industries公司；IKA RT5型數顯恒溫磁力攪拌器：德國IKA有限公司；Spectrum 10型傅里葉變換紅外光譜儀：美國PE公司；DBD-50等離子體反應器：南京蘇曼有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DBD-CP處理

稱取一定量的酪蛋白粉末樣品于石英反應皿中（d=90 mm），使用DBD-50等離子體反應器處理樣品，不同的條件（處理電壓和處理時間）設置如下：處理電壓變化組在處理時間為60 s的條件下，電壓設定為0、30、40、50、60 V 和 70 V；處理時間變化組在 50 V 的處理電壓下，處理時間為 0、15、30、45、60、90 s和 120 s。各處理均在石英反應器上進行，所有樣品均以（2.0±0.2）A電流處理，試驗進行3次重復。

1.3.2 制膜方法

用0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液溶解DBD-CP處理后的酪蛋白粉末，并添加甘油作為增塑劑，成膜液為酪蛋白∶甘油∶氫氧化鈉溶液=5∶1∶30（體積比）的乳狀液。為了使其快速混合，將混合物置于50℃恒溫磁力攪拌器中攪拌，隨后對成膜液進行除氣。攪拌均勻后，小心地將成膜液傾注到聚丙烯酸板上（15 cm×15 cm）。然后將所有的膜樣保存在恒溫恒濕箱中，調節相對濕度為50%，溫度為25℃，放置48 h。隨后，將所有薄膜樣品剝離，并將其置于50%相對濕度的恒溫恒濕箱中，室溫保存7 d，以評估薄膜性能。所有膜樣品均做3個平行。

1.3.3 掃描電子顯微鏡

利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）對酪蛋白膜的微觀結構進行了研究，粉末樣品和薄膜樣品分別用導電雙面膠固定在樣品臺上，隨后噴金。在加速電壓為5 kV時進行SEM掃描。對DBD-CP處理后的酪蛋白粉末制備成的膜進行形態學觀察[14]。

1.3.4 X射線衍射

用X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀測量處理后樣品的結晶度。將粉末樣品平鋪在樣品臺上，并刮去多余的樣品，并且薄膜樣品剪裁成4 cm×3.3 cm的規格固定在儀器的樣品臺。設定電流30 mA，電壓40 kV，以 5 °/min 的速度掃描 10°～80°[15]。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，FTIR）

將制備的薄膜樣品使用傅里葉變換紅外光譜的衰減全反射模式對樣品進行功能基團和二級結構的變化分析。對于每個薄膜樣品，在4 000 cm-1～1 000 cm-1的波數范圍內進行4 cm-1分辨率的掃描。然后用Omnic 8.2軟件對樣品的光譜進行分析[16]。

1.3.6 差示掃描量熱法

采用差示掃描量熱法（differential scanning calorimeter，DSC）表征酪蛋白膜的熱穩定性。將8 mg～10 mg的膜樣以5℃/min的升溫速率加熱，溫度從25℃提高到500℃。氮氣流量為20 cm3/min[17]。

1.3.7 機械性能

薄膜的拉伸強度（TS）和斷裂伸長率（EAB）用質構儀測定。將膜切成10 mm×40 mm的條狀，樣品放入膜延長夾具中。初始夾距設定為20 mm，拉伸速度為10 mm/s，有效拉伸距離為20 mm。記錄薄膜樣品的TS和EAB值，測量3次[18]。按照以下計算公式進行計算。

式中：Ft為膜破裂時記錄的最大載荷，N；T為膜厚，mm；W為膜寬，20 mm；ΔL是膜的伸長長度，mm；L0為膜的初始長度，70 mm。

1.3.8 水蒸氣透過率測定

采用擬杯狀法測定膜的阻隔性。稱取干燥氯化鈣3.0 g（120℃干燥12 h）加入恒重玻璃杯中，將薄膜密封在玻璃杯上，稱量被薄膜覆蓋的玻璃杯的質量。然后將玻璃杯置于恒溫恒濕箱中，溫度為25℃，相對濕度為50%。每隔1 h測量薄膜覆蓋玻璃杯的質量，并記錄數據。連續測量7 h[19]。通過以下公式進行計算。

式中：WVP為水蒸氣透過率，g·m/（Pa·s·m2）；ΔW為杯重增加量，g；L 為膜厚，m；t為測量時間，s；A 為測量面積，m2；ΔP 為杯內外壓力差，Pa。

1.4 數據分析

每組試驗至少3組平行并重復2次～3次。試驗結果主要采用軟件SPSS Statistics 20中的Duncan檢驗，在置信區間95%的水平用ANOVA分析方法進行數據顯著性分析，p＜0.05時認為差異顯著。用不同字母表示差異顯著（p＜0.05），用軟件 Origin8.5繪圖。

2 結果與分析

2.1 表觀形貌

2.1.1 酪蛋白形態結構

DBD-CP處理酪蛋白的SEM圖像如圖1所示。

DBD-CP處理改變了酪蛋白粉末的表面粗糙度，酪蛋白粉末表面由光滑變為粗糙；同時，隨著處理時間延長和電壓的增加，酪蛋白膠束的粒徑減小。這與DBD-CP放電過程中產生的蝕刻作用有關，DBD-CP處理產生的高能粒子撞擊酪蛋白粉末表面，顯著改變其表觀形貌[20]。此外，DBD-CP放電過程中產生大量電子、離子等活性物質攻擊酪蛋白，也會導致化學鍵斷裂、鏈斷裂、化學降解、低分子量碎片去除等化學和物理變化，進而會影響膜的結構和理化性質[21]。

2.1.2 成膜的形態結構

對處理后的酪蛋白制成的膜的形態學進行分析，結果如圖2所示。

膜表面有大量的晶體，晶體數量隨著處理電壓和處理時間的增加而變化。同時，圖2中的截面呈現出相反的趨勢，處理時間變化組中，表面隨著處理時間延長，晶體量呈增多趨勢；而在截面中，隨著處理時間的增加，晶體量逐漸減少。

電子掃描顯微鏡的能譜如圖3所示。

由圖3可以看出，表面的晶體與Na+的結構最為相似，因此，可推測其為Na+組成的晶體。晶體隨DBDCP處理發生變化的原因可能是晶體隨著酪蛋白粉末中的水產生了遷移，但這一解釋需要進一步的試驗研究來證實。

2.2 XRD分析

DBD-CP處理酪蛋白粉末的XRD圖譜如圖4所示。

由圖4可見，寬的衍射峰發生在未經處理的酪蛋白樣品中，2 θ=20°。經比較，DBD-CP處理后的蛋白峰值降低，說明蛋白內螺旋側鏈結構含量與之相關，性質不穩定，易受環境等因素影響[22]。隨著處理電壓和處理時間的增加，沒有新的衍射峰出現，這意味著DBD-CP處理不能使得酪蛋白中產生新的晶體結構。從圖4A可以看出，衍射強度隨著處理時間的延長逐漸增大，直到60 s達到峰值，然后減小。如圖4B所示，衍射峰強度隨著處理電壓的增加而逐漸減小，尤其表現在2 θ=20 °～25 °處。

DBD-CP處理酪蛋白粉末后制成的膜的XRD圖譜如圖5所示。

從圖像的趨勢可以看出，各峰值隨處理時間延長而增高，在50 V 60 s達到最高。處理電壓變化組中，隨著處理電壓強度的增加峰的強度增強，直到50 V，然后下降。據悉，晶體的尺寸和晶體的折疊都會引起X射線衍射峰的變化[23]。因此，晶體衍射峰發生的變化可能是由于DBD-CP放電破壞了酪蛋白質的結構，致使成膜后的晶體結構發生了變化。

2.3 蛋白質二級結構分析

DBD-CP處理后酪蛋白粉末制成的膜的紅外光譜如圖6所示。

FTIR光譜是根據結構振動來分析分子水平上的結構變化來探討官能團的轉移。等離子體處理對3 600 cm-1～3 300 cm-1的振動產生了影響，這個波數范圍為O—H和N—H的特征振動，這是由于當分子間或分子內氫鍵形成時，羥基的吸收峰向較低的波數移動[24]。在處理時間變化組中，可以看出隨著處理時間的延長，樣品的吸收峰逐漸變寬，波數在3 400 cm-1處略有變化，這表明DBD-CP對蛋白質中O—H產生了一定的影響。

酰胺Ⅰ區的波數范圍為1700 cm-1～1600 cm-（1CO拉伸振動），這與蛋白質的二級結構密切相關。蛋白質的二級結構包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲結構。不同的二級結構信息疊加在酰胺Ⅰ帶上，而酰胺Ⅰ帶的二階導數光譜保留了吸收峰的積分面積。波數與二級結構的關系：1 610 cm-1～1 640 cm-1為 β-折疊特征峰；1 660 cm-1～1 670 cm-1和 1 680 cm-1～1 700 cm-1為 β-轉角特征峰；1 650 cm-1～1 660 cm-1為 α-螺旋特征峰；1 640 cm-1～1 650 cm-1為無規卷曲特征峰[25]。

不同處理時間和不同處理電壓的樣品的二級結構的含量見表1。

表1 DBD-CP處理的酪蛋白粉末制備成膜的二級結構Table 1 Secondary structure of films made from casein power samples treated by DBD-CP

隨著DBD-CP處理時間的延長，β-折疊在50 V 90 s達到最高值（37.57%）。在處理電壓變化組中，β-折疊在40 V 60 s的處理條件下含量為74.15%，而在70 V 60 s時則含量為17.48%。α-螺旋含量均比對照組含量低，其中在40 V 60 s時含量最少。由此可以得出結論：DBD-CP處理后酪蛋白的α-螺旋結構以及二

級結構中的無規卷曲均受到影響。然而，無規卷曲可以改變肽鏈的方向，這有利于α-螺旋和β-折疊持有相對剛性的連接結構[26]。因此，DBD-CP處理酪蛋白粉末后可影響酪蛋白膜的結構穩定性。

2.4 熱穩定性分析

差示掃描量熱法是研究蛋白質穩定性熱力學的主要工具。熱性能對食品包裝材料的生產和滅菌過程具有重要影響，不同處理條件的DSC結果如圖7所示。

圖7結果表明，所有薄膜均表現出2種～3種典型的吸熱過程。第1個峰是結晶峰，與樣品物質的結晶度有關[27]。從第1個峰可以看出，與對照組相比，除30 V 60 s外所有組的峰值均有不同程度的降低，同時各處理組的結晶峰均有不同程度的加強。結合傅里葉紅外光譜的分析結果，可以推測出DBD-CP改變了酪蛋白的分子結構，破壞了分子間和分子內氫鍵，改變了聚合物的連接狀態，從而影響了膜的熱穩定性。除處理條件在50 V 45 s的樣品外，其余處理時間變化組的第二個峰值（Tp值）高于對照組，在50 V 60 s的處理條件下達到最大值245.2℃。電壓變化組在40V60s和70V 60 s條件下的Tp值低于對照組，并且在等離子處理后酪蛋白分子結構發生變化，破壞了相應的變化結構。這些相關現象的變化與掃描電鏡及紅外光譜結構分析結果一致。DBD-CP處理可以通過改變酪蛋白分子間結構以及分子在膜液體中的聚集和晶體結構來改善酪蛋白膜的熱穩定性。

2.5 機械性能分析

商品在生產過程中，會受到壓力、沖擊、振動等靜態和動態因素的影響。因此包裝材料應具有有效保護產品的特性，并具有一定的強度、韌性和彈性。DBDCP酪蛋白粉末制備成膜樣品的力學性能如圖8所示。

在酪蛋白膜的制備過程中加入甘油，有利于酪蛋白膜的形成，提高酪蛋白膜的力學性能。以往的許多研究表明，DBD-CP處理蛋白膜后，其拉伸強度和斷裂伸長率得到了提高[28]。然而，從圖8中可以看出，DBDCP處理酪蛋白粉末制成的膜并沒有顯示出這種趨勢。處理時間變化組與對照組相比較具有顯著性差異（p＜0.05）。隨著處理時間的延長，TS值逐漸減小，其中在50V 90 s時TS值最小。處理時間變化組在30 s和45 s、30 s和60 s之間差異無顯著性（p＞0.05），TS值變化不大。圖8A中可以看出，DBD-CP無論在處理電壓變化組還是處理時間變化組中，機械強度均發生了顯著的降低（p＜0.05）；圖8B中可以清晰看出，EAB值也隨著電壓的升高而變化，與對照組相比，在50 V 60 s時EAB值最低，在處理條件為60 V 60 s的時候，EAB顯著高于對照組，結合紅外二級結構分析得出DBD-CP處理后蛋白膜的TS值降低可能是由于經過處理后的酪蛋白粉末的二級結構發生了變化。α-螺旋多肽鏈的蛋白質可以扭曲在一起以提高其機械強度和靈活性。無規則卷曲和α-螺旋結構的減少也影響膜的力學性能。因此，可以得出：DBD-CP處理的酪蛋白粉末二級結構中的α-螺旋和無規則卷曲被破壞，從而降低了酪蛋白膜的機械強度，但是增加了酪蛋白膜的極限拉伸率。

2.6 水蒸氣透過率

包裝材料的阻水性是決定食品保質期的重要因素，水蒸氣透過率代表了薄膜阻止水分子從外部環境遷移到產品中的能力，然而有些膜材料卻需要具有一定的水蒸氣透過率（如：腸衣等），一定的水蒸氣透過率有助于降低薄膜在熱處理時因水蒸氣不能透過而引起的漲破。DBD-CP時間變化組和電壓變化組對薄膜水蒸氣透過率的影響如圖9所示。

水蒸氣透過率的大小主要受包裝材料的組成物質及空間結構的影響[29]。圖9顯示了DBD-CP時間變化組和電壓變化組對薄膜水蒸氣透過率的影響，總體趨勢是先上升后下降再上升。從圖中可以看出處理條件為40V60s的水蒸氣透過率顯著高于對照組（p＜0.05），增加了127.4%。而50 V與60 V比較無顯著性差異（p＞0.05）。同時等離子體處理時間延長組也表現出整體上先上升后下降的趨勢。這可能是由于等離子體放電破壞了酪蛋白的結構，使其聚集且表面結構也變疏松，從而減弱了水蒸氣的阻隔性能。

3 結論

綜上所述，介質阻擋放電低溫等離子體（dielectric barrier discharge-cold plasma，DBD-CP）處理改變了酪蛋白的結構，使酪蛋白粉末表面由光滑變得粗糙，同時結合傅里葉紅外變換光譜的結果與DSC結果可以發現，DBD-CP處理還破壞了氫鍵，改變了聚合物的連接狀態，使酪蛋白的穩定性發生變化。通過與未處理的樣品相比，經過DBD-CP處理的樣品由于結構發生的改變從而促使酪蛋白膜的熱穩定性得到了提高（在50 V 60 s的處理條件下Tp值可達245.2℃），并且在處理條件為40 V 60 s時，樣品的水蒸氣透過率顯著高于未處理的樣品，這說明DBD-CP處理有效地改變了酪蛋白膜的水蒸氣透過率。這為低溫等離子體改性膜原料的選擇提供了參考依據。