葛根與茶多酚體內(nèi)外協(xié)同輔助降血糖活性探究

袁傳勛，王津坤，金日生，王敏，李亮

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

糖尿病是世界上最常見的代謝紊亂疾病之一，其主要特征是胰島素分泌減少或胰島素抵抗引起的高血糖[1-2]，糖尿病已成為世界第五大死亡原因，國際糖尿病聯(lián)合會預(yù)測，到2035年，全世界將有5.92億人患糖尿病[3]，糖尿病在引起高血糖的同時還會引起糖尿病腎病、糖尿病相關(guān)心臟疾病、糖尿病神經(jīng)病變和糖尿病足等多種并發(fā)癥[4]?，F(xiàn)如今糖尿病高血糖的控制方法主要為口服藥物，但長期服用口服降糖藥可能會產(chǎn)生副作用，如阿卡波糖會引起胃腸道疾病、格列本脲會引起粒細(xì)胞減少和低血糖癥、二甲雙胍會引起乳酸酸中毒。藥食同源的中藥除了具有保健效果外，還具有不良反應(yīng)較少的優(yōu)點[5]，在治療慢性病等領(lǐng)域具有廣泛的前景。

葛根既是食材又是藥材，產(chǎn)地廣泛，在古代就是治療糖尿病（消渴癥）的主要藥材之一[6]，其具有多種功效，如解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉等[7]。葛根異黃酮是葛根的主要活性成分，研究表明葛根異黃酮在解酒、護(hù)肝、抗氧化、降血糖與降血脂等多方面都具有活性[8-9]。茶多酚是綠茶中的主要活性成分，其中大部分是兒茶素及其衍生物，研究表明其具有廣泛的藥理作用諸如減肥、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗癌、抗炎抑菌等[10-11]。韋芳媚等[12]對桑葉提取物與茶多酚的協(xié)同降血糖與協(xié)同抗氧化作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明桑葉提取物與茶多酚在對糖尿病關(guān)鍵酶的抑制作用優(yōu)于兩種成分單獨作用，為植物提取物應(yīng)用于功能性茶飲料提供了參考；趙磊等[13]將南瓜、山藥、葛根與桑葉復(fù)配研究對糖調(diào)節(jié)受損改善作用，結(jié)果表明配方可從改善糖代謝、脂代謝、氧化應(yīng)激等多種途徑預(yù)防小鼠因高糖引起的糖調(diào)節(jié)受損。本文研究了葛根提取物與茶多酚在體外對α-葡萄糖苷酶協(xié)同抑制效果及體內(nèi)對2型糖尿病小鼠協(xié)同治療的效果，為葛根提取物與茶多酚復(fù)配應(yīng)用于輔助降血糖功能性食品的開發(fā)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物

5周齡雄性昆明小鼠：SPF級，安徽醫(yī)科大學(xué)。

1.1.2 試劑

綠茶提取物：圣嘉德生物科技有限公司；葛根提取物：上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶：西格瑪-奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖苷 （＞99%）（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）：上海麥克林生化科技有限公司；阿卡波糖：中美華東制藥有限公司；鏈脲佐菌素（≥98.00%）：翌圣生物科技有限公司；鹽酸二甲雙胍：北京圣永制藥有限公司；小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）測定試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（BSG-26）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電子天平（ATY124）：力辰儀器有限公司；紫外-可見光分光光度計（UV-1800PC）：翱藝儀器有限公司；血糖儀（悅準(zhǔn)Ⅱ型306）：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；全波長酶標(biāo)儀（Varioskan Flash）：賽默飛世爾科技；臺式高速離心機(jī)（TG16-WS）：湖南湘鑫儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根提取物與綠茶提取物中有效成分含量測定

1.3.1.1 葛根異黃酮含量測定

采用紫外-分光光度法對葛根提取物中葛根異黃酮的含量進(jìn)行測定[14]。將4.0 mg葛根素標(biāo)準(zhǔn)品用70%乙醇溶液溶解于10 mL容量瓶中，配制成0.4 mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為母液。再分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL母液，用70%乙醇溶液定容于25 mL容量瓶中，配制成梯度濃度為 3.2、6.4、9.6、12.8、16.0 μg/mL的系列工作液，以70%乙醇作為空白對照，在250 nm處測定吸光度，以葛根素濃度（μg/mL）為X，吸光度為Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=0.056 15X-0.015 05，R2=0.999 6。

取10.0mg樣品溶于50mL70%乙醇中，吸取1.0mL，再溶于50 mL 70%乙醇中，在250 nm處測定吸光度，并通過以上標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中葛根異黃酮含量。

1.3.1.2 茶多酚含量測定

采用酒石酸亞鐵法對樣品中茶多酚含量進(jìn)行測定[15]。配制梯度濃度的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并取1 mL茶多酚溶液在25 mL容量瓶中加入5 mL酒石酸亞鐵溶液與4 mL去離子水，再用pH6.9的磷酸緩沖液定容至25 mL，在540 nm處對吸光度進(jìn)行測定，以茶多酚濃度（mg/mL）為X，吸光度為Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=0.331 8X+0.003 3，R2=0.999 8。

取200 mg樣品，用去離子水定容至100 mL作為樣品溶液，取1 mL樣品溶液在25 mL容量瓶中加入5 mL酒石酸亞鐵溶液與4 mL去離子水，并用pH6.9磷酸緩沖液定容至25 mL，在540 nm處測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中茶多酚的含量。

1.3.2 體外降血糖協(xié)同效果的探究

1.3.2.1 α-葡萄糖苷酶活性的抑制

參考文獻(xiàn)[16]的方法并略作修改。加入100 μL不同濃度的樣品溶液及100 μL的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃預(yù)熱 20 min后，加入 100 μL p-NPG，在 37℃下反應(yīng)30 min，加入500 μL Na2CO3溶液終止反應(yīng)，加入500 μL pH6.8磷酸緩沖液后，在405 nm下測定吸光度，記為A樣品。以緩沖液代替樣品溶液，作為對照組，測量吸光度記為A對照；以緩沖液代替酶溶液，作為背景組，測量吸光度記為A背景；以緩沖溶液替代酶溶液和樣品溶液，作為空白組；以阿卡波糖溶液替代樣品溶液，作為陽性對照組。抑制率的計算公式如下。

1.3.2.2 葛根提取物與茶多酚半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）

配制梯度濃度的葛根提取物溶液與茶多酚溶液，按1.3.2.1方法進(jìn)行不同濃度樣品α-葡萄糖苷酶抑制率的測定。葛根提取物與茶多酚的濃度與其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率均具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，符合中效原理，參照Chou與Talary公式[17]，其中樣品濃度記為D，抑制率為50%時的樣品濃度記為Dm，D濃度時的抑制率記為fa，m為劑量-效應(yīng)曲線的系數(shù)，其對數(shù)形式如下。計算出抑制率為50%時的濃度，即IC50。

1.3.2.3 最佳協(xié)同抑制質(zhì)量比

將茶多酚與葛根提取物分別按質(zhì)量比 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 進(jìn)行復(fù)配，并參照 1.3.2.1 方法對 α-葡萄糖苷酶活性的抑制率進(jìn)行測定。

1.3.2.4 聯(lián)合指數(shù)的測定

聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）是評價藥物協(xié)同效果的一個指標(biāo)[18]，兩種藥物分別記作藥物1與藥物2，其中藥物1單獨作用時抑制率為50%的濃度為（D）1，藥物2單獨作用時抑制率為50%的濃度為（D）2，藥物1與藥物2聯(lián)合作用時抑制率為50%的各自的濃度分別為（D）x1與（D）x2，CI的計算方法如下。當(dāng)CI值＞1.1時，兩種物質(zhì)呈拮抗效果；CI值介于0.9與1.1之間時，兩種物質(zhì)呈現(xiàn)相加效果；CI值＜0.9時，兩種物質(zhì)呈協(xié)同效果。

按1.3.2.3中最佳質(zhì)量比配制梯度濃度溶液，并計算兩種物質(zhì)復(fù)配時各自的IC50，并代入上述式中計算，得到葛根提取物與茶多酚的CI，并根據(jù)CI值判定葛根提取物與茶多酚對α-葡萄糖苷酶體外抑制是否具有協(xié)同作用。

1.3.3 體內(nèi)輔助降血糖協(xié)同效果的探究

1.3.3.1 2型糖尿病小鼠模型的建立及分組給藥

56只小鼠以每組8只分為7組，分別為空白組、模型組、陽性對照組、葛根提取物組、茶多酚組、低劑量協(xié)同組、高劑量協(xié)同組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除空白組外，其余各組改用高脂飼料（膽固醇1%、豬油8%、蛋黃粉5%、蔗糖10%、基礎(chǔ)飼料76%）喂養(yǎng)，喂養(yǎng)期間自由飲水進(jìn)食。在高脂飼料喂養(yǎng)4周后用1%鏈脲佐菌素溶液按40 mg/kg劑量腹腔注射進(jìn)行2型糖尿病建模（空白組注射生理鹽水作為對照），連續(xù)注射4 d后進(jìn)行空腹血糖測定，空腹血糖值大于11.1 mmol/L[19]即為造模成功。各小組成功造模后進(jìn)行灌胃給藥?？瞻捉M與模型組使用蒸餾水灌胃、陽性對照組使用150 mg/kg鹽酸二甲雙胍灌胃進(jìn)行給藥、葛根提取物組灌胃400 mg/kg葛根提取物、茶多酚組灌胃200 mg/kg茶多酚、協(xié)同低劑量組灌胃200 mg/kg葛根提取物與100 mg/kg茶多酚、協(xié)同高劑量組灌胃400 mg/kg葛根提取物與200 mg/kg茶多酚。連續(xù)灌胃給藥4周后，乙醚麻醉，摘除眼球取血后斷頸處死。

1.3.3.2 小鼠體質(zhì)量及空腹血糖測定

在飼養(yǎng)過程中，每周進(jìn)行體質(zhì)量與空腹血糖的測量，測量均在斷食不斷水12 h后進(jìn)行，空腹血糖采用尾端取血方法進(jìn)行測定。

1.3.3.3 小鼠糖耐量指標(biāo)

處死前斷食12 h后對各組小鼠的空腹血糖進(jìn)行測定，然后對各組小鼠灌胃2 g/kg bw葡萄糖溶液，于灌胃后0.5、1.0、2.0 h測定小鼠血糖，采用梯形面積法[20]計算糖耐量曲線下面積（area under curve of glucose，AUC）并比較各組小鼠間AUC的差異。

式中：a為0 h血糖值，mmol/L；b為0.5 h血糖值，mmol/L；c為 1h血糖值，mmol/L；d為2h血糖值，mmol/L。

1.3.3.4 對小鼠血清胰島素含量的影響

小鼠眼球血在4 000 r/min下離心5 min，得到小鼠血清。使用小鼠胰島素ELISA試劑盒對小鼠血清中胰島素（insulin，INS）含量進(jìn)行測定，操作方法參照試劑盒說明書。

1.3.3.5 對小鼠穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)與穩(wěn)態(tài)模型胰島素分泌指數(shù)的影響

除了INS值外，對小鼠糖尿病情況的判斷還需要結(jié)合空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）值通過以下兩個公式進(jìn)行計算分析。

其中，穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)[21]（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）的計算公式如下。

穩(wěn)態(tài)模型胰島素分泌指數(shù)[22]（homeostasis model assessment-β，HOMA-β）的計算公式如下。

根據(jù)1.3.3.2方法與1.3.3.4方法中得到的FBG與INS進(jìn)行計算，得到小鼠HOMA-IR與HOMA-β值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性分析。使用Excel 2017與Origin 2018對數(shù)據(jù)處理及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料中主要成分含量的測定

2.1.1 葛根異黃酮含量的測定

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出葛根提取物樣品中葛根異黃酮的含量為（51.60±0.45）%。

2.1.2 茶多酚含量的測定

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出綠茶提取物樣品中茶多酚的含量為（81.33±0.12）%。

2.2 葛根提取物與茶多酚體外輔助降血糖效果的驗證

2.2.1 葛根提取物與茶多酚IC50結(jié)果

茶多酚、葛根提取物與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制效果的劑量-效應(yīng)曲線分別如圖1～圖3所示。

由圖1和圖2可知，茶多酚與葛根提取物對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，其抑制效果均隨樣品濃度的增大而逐漸增加，直到接近完全抑制。根據(jù)計算，茶多酚對α-葡萄糖苷酶的IC50為0.1159μg/mL，而葛根提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50為1.000 μg/mL。同時對陽性對照物阿卡波糖進(jìn)行測定，結(jié)果測得阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50為61.781 μg/mL，說明單獨使用時，葛根提取物與茶多酚均具有良好的體外降血糖活性。

2.2.2 葛根提取物與茶多酚最佳復(fù)配質(zhì)量比的確定

葛根提取物與茶多酚不同質(zhì)量比復(fù)配下對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)葛根提取物與茶多酚的質(zhì)量比為2∶1時，對α-葡萄糖苷酶抑制率最高，可達(dá)到（88.65±1.91）%。因此將2∶1作為后續(xù)試驗中葛根提取物與茶多酚復(fù)配時的質(zhì)量比。

2.2.3 葛根提取物與茶多酚CI值的測定

在保持葛根提取物與茶多酚的質(zhì)量比為2∶1條件下，配制梯度濃度溶液進(jìn)行抑制α-葡萄糖苷酶試驗，得到的劑量-效應(yīng)曲線如圖5所示（以茶多酚濃度計）。

由圖5可知，葛根提取物與茶多酚在進(jìn)行復(fù)配時的 IC50分別為 0.133 1 μg/mL 與 0.066 55 μg/mL，并計算出CI為0.707 3，小于0.9，說明葛根提取物與茶多酚在α-葡萄糖苷酶活性的抑制上具有良好的協(xié)同效果。葛根異黃酮與茶多酚均屬于多酚類物質(zhì)，其代表性結(jié)構(gòu)為苯環(huán)與雜環(huán)六元吡喃或吡喃酮縮合，并在吡喃環(huán)或吡喃酮上有苯環(huán)作為取代基。多酚可以通過與酶結(jié)合，占據(jù)底物結(jié)合位點或結(jié)合后改變酶的構(gòu)象，使底物無法與酶結(jié)合，達(dá)到對酶活性的抑制。茶多酚與葛根異黃酮中苯環(huán)上具有多處酚羥基取代，可以通過范德華力或疏水鍵等與α-葡萄糖苷酶上不同的位點相結(jié)合，進(jìn)而達(dá)到對酶活性的協(xié)同抑制作用[23]。

2.3 葛根提取物與茶多酚協(xié)同體內(nèi)輔助降血糖效果的驗證

2.3.1 小鼠體質(zhì)量與空腹血糖變化

2.3.1.1 小鼠體質(zhì)量變化

實驗期間，小鼠體質(zhì)量變化情況如圖6所示。

由圖6可知，在適應(yīng)性喂養(yǎng)與高脂飼料喂養(yǎng)期間，各組小鼠的體質(zhì)量逐漸增長，空白組由于使用普通飼料進(jìn)行喂食，其體質(zhì)量低于其他喂食高脂飼料的各組。經(jīng)過造模與灌胃給藥后，空白組的體質(zhì)量持續(xù)升高，其他各組小鼠的體質(zhì)量均有明顯下降，以模型組小鼠的體質(zhì)量下降最為顯著，各給藥組相對與模型組消瘦情況均有一定的改善，茶多酚對糖尿病小鼠的消瘦情況改善效果最弱，而經(jīng)過與葛根提取物復(fù)配后，對糖尿病小鼠消瘦改善效果增強(qiáng)。

2.3.1.2 小鼠空腹血糖變化

實驗期間，小鼠空腹血糖變化情況如圖7所示。

各組小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)與高脂飼料喂養(yǎng)期間的空腹血糖保持在穩(wěn)定狀態(tài)。由圖7可知，建模后，除空白組外，各組小鼠的空腹血糖均超過了11.1 mmol/L，表明建模成功。在灌胃給藥過程中，空白組小鼠空腹血糖小于11.1 mmol/L，處于正常范圍內(nèi)，模型組小鼠空腹血糖大于11.1 mmol/L，無下降趨勢，而陽性對照組、葛根提取物組、茶多酚組、協(xié)同低劑量組與協(xié)同高劑量組小鼠空腹血糖在灌胃給藥4周過程中均呈下降趨勢，說明葛根提取物與茶多酚對小鼠血糖均具有輔助下調(diào)效果。相對于使用單組分進(jìn)行灌胃給藥，協(xié)同高劑量組小鼠空腹血糖的下降趨勢更加明顯，當(dāng)灌胃4周后其空腹血糖平均值小于11.1 mmol/L，恢復(fù)到正常水平，說明茶多酚與葛根提取物對糖尿病小鼠具有協(xié)同治療效果。

2.3.2 對小鼠AUC的影響

各組小鼠AUC計算結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，對小鼠的糖耐量實驗中，各灌胃給藥組小鼠的AUC均大于空白組，但均小于模型組，與空白組、模型組比較均具有極顯著性差異（p＜0.01），在各給藥組中，協(xié)同高劑量組小鼠的AUC值最低。AUC反映了小鼠對葡萄糖的耐受情況，是糖尿病考察的重要指標(biāo)。結(jié)果表明茶多酚與葛根提取物對糖尿病小鼠糖代謝紊亂具有改善效果，茶多酚與葛根提取物復(fù)配后對糖尿病小鼠糖代謝紊亂具有協(xié)同改善效果。糖耐量除受到腸道內(nèi)α-葡萄糖苷酶等雙糖酶活性的影響外，還受到體內(nèi)INS分泌量、機(jī)體胰島素抵抗等多方面因素影響，因此需要結(jié)合INS分泌量進(jìn)行進(jìn)一步分析[24]。

2.3.3 對小鼠血清胰島素含量的影響

對小鼠的INS測定結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，空白組的INS分泌含量最低，建模后，各組小鼠的INS均增加，給藥后各組的INS分泌量進(jìn)一步上升，而協(xié)同高劑量組的INS含量最高，與模型組具有顯著差異（p＜0.05），其次為茶多酚組，其余各組INS含量相差不大。INS分泌量受到胰島β細(xì)胞損傷情況與胰島素抵抗等多種因素影響，因此需要引入HOMA-IR與HOMA-β等穩(wěn)態(tài)模型對小鼠糖尿病情況進(jìn)一步分析。

2.3.4 對小鼠HOMA-IR與HOMA-β的影響

小鼠HOMA-IR計算結(jié)果如圖10所示。

由圖10可知，小鼠在建模后出現(xiàn)胰島素耐受情況。在灌胃給藥后，茶多酚組HOMA-IR與模型組無顯著性差異，說明單獨使用茶多酚改善模型小鼠的胰島素耐受不明顯（p＞0.05）。其余各給藥組HOMA-IR均小于模型組且具有顯著差異（p＜0.05），在各給藥組中，協(xié)同高劑量組小鼠HOMA-IR值最低，說明除茶多酚組外，其他各給藥組小鼠的胰島素抵抗情況均有明顯改善，而葛根提取物與茶多酚的高劑量協(xié)同對糖尿病小鼠的胰島素抵抗情況改善效果最佳。同時，可通過HOMA-β分析糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞損傷是否得到修復(fù)。

小鼠HOMA-β結(jié)果如圖11所示。

由圖11可知，模型組HOMA-β極顯著低于空白組（p＜0.01），說明建模后小鼠胰島β細(xì)胞功能受到了損傷。經(jīng)過灌胃投藥后，各投藥組小鼠HOMA-β相較于模型組均有一定增加，但只有協(xié)同高劑量組具有極顯著增長（p＜0.01），同時，協(xié)同高劑量組小鼠HOMA-β與空白組間無顯著性差異，說明協(xié)同高劑量組小鼠胰島β細(xì)胞所受損傷得到較好修復(fù)。葛根提取物與茶多酚在修復(fù)胰島β細(xì)胞所受損傷具有良好的協(xié)同作用。

3 結(jié)論

本文探究了葛根提取物與茶多酚體內(nèi)外的協(xié)同降血糖活性。體外輔助降血糖活性通過對α-葡萄糖苷酶活性的抑制進(jìn)行測定，當(dāng)葛根提取物與茶多酚質(zhì)量比為2∶1時，具有最佳的協(xié)同效果，通過中效原理與聯(lián)合指數(shù)計算得出兩者CI<0.9，具有良好的體外協(xié)同降血糖效果。使用葛根提取物與茶多酚單獨或復(fù)配后對2型糖尿病模型小鼠進(jìn)行灌胃給藥，進(jìn)一步驗證體內(nèi)協(xié)同降血糖效果，在協(xié)同高劑量下給藥4周后可使小鼠的血糖下降至11.1 mmol/L以下，恢復(fù)至正常值，而其他各給藥組對比協(xié)同高劑量組效果略差，說明葛根提取物與茶多酚在體內(nèi)同樣具有良好的協(xié)同降血糖效果。同時，高劑量協(xié)同給藥能夠增加模型小鼠胰島素靶器官敏感性，刺激小鼠胰島β細(xì)胞分泌胰島素，這可能是葛根提取物與茶多酚進(jìn)行協(xié)同降血糖的主要途徑。

綜上所述，葛根提取物與茶多酚在體內(nèi)外均具有良好的協(xié)同輔助降血糖效果，可以將其活性成分進(jìn)一步開發(fā)為輔助降血糖功能性食品或飲品，但其具體的作用途徑與協(xié)同機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。