茶樹與梨樹槲寄生中酚類和萜類化合物的結構鑒定

劉海哲，鄒青飛，郭馨昕，陳壁，黃勇樺，張建平，初雅潔，李淳，劉先皓，楊士花，李永強*

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南云測質量檢測有限公司，云南 昆明 650201；3.德宏州食品藥品檢驗所，云南 德宏 678400；4.凱里學院大健康學院，貴州 凱里 556011；5.滇西應用技術大學普洱茶學院，云南 普洱 665099；6.云南昆明國家糧食儲備中轉庫，云南 昆明 650201；7.大理農林職業技術學院，云南 大理 671003；8.永平縣綜合檢驗檢測院，云南 大理 671003；9.云南農業大學圖書館，云南 昆明 650201）

槲寄生[Viscum coloratum（Kom.）Nakai]屬于檀香目（Santalales）的一種半寄生植物，主要寄生在桑科、茶科、薔薇科和豆科等植物上[1]。在傳統中醫中被廣泛用于治療炎癥、痛風、心臟病和高血壓等疾病[2]。研究發現，槲寄生不僅含有蛋白質和碳水化合物等營養成分，還含有豐富的酚類化合物、萜類化合物、凝集素和生物堿等活性成分，對人體健康具有較好的促進作用[3]。酚類和萜類化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌和抗病毒等作用[4]，受到人們的廣泛關注。

茶樹、梨樹槲寄生在云南省主要分布于普洱、德宏和西雙版納等地區[5]。目前對茶樹槲寄生多酚開展了一定的研究，但對梨樹槲寄生的研究較少。倪婷婷等[6]測定了茶樹槲寄生中多酚和黃酮的含量，并利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法鑒定出12種酚類化合物，主要為黃酮醇和黃烷醇。研究發現茶樹槲寄生的水提物對常見的食源性微生物和致病菌具有較好的抑菌作用[5]。同時，Li等[7]研究發現茶樹槲寄生為扁枝槲寄生（Viscum articulatum Burm.f.），梨樹槲寄生為楓香槲寄生（Viscum liquidambaricolum Hayata），這兩種槲寄生中均含有豐富的多酚和黃酮，且均具有較好的抗氧化活性，并在兩種槲寄生中鑒定出18種酚類化合物，主要包括羥基苯甲酸、羥基肉桂酸和類黃酮。

目前對茶樹槲寄生中的酚類化合物進行了一定的研究，但梨樹槲寄生中的活性成分研究較少，同時關于兩種槲寄生中萜類化合物的研究鮮見。本文在前期研究的基礎上，采用超高壓液相色譜-四極桿飛行時間質譜（ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）法，對茶樹、梨樹槲寄生中的酚類和萜類化合物進行系統的結構鑒定，可為茶樹、梨樹槲寄生的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹與梨樹槲寄生：采自云南省普洱市景邁山；甲醇（色譜級）：德國Merck公司；乙酸（色譜級）：美國Sigma公司；乙腈（色譜級）：美國Honeywell公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平（FA2004）：沈陽龍騰電子有限公司；超聲波清洗器（KQ-500B）：昆山市超聲儀器有限公司；離心機（TGL20M）：湖南湘立科學儀器有限公司；超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜聯用儀（1290 UPLC-6545Q-TOF）：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將粉碎干燥的槲寄生過40目篩，準確稱取2.0 g槲寄生粉置于50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇并混勻，室溫下超聲輔助提取15 min，4℃下8 000×g離心10 min，重復提取3次，合并上清液用N2吹至近干，加入2 mL甲醇復溶，過0.2 μm有機濾膜，濾液用于UPLC-Q-TOF-MS分析。

1.3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析條件

色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫 40 ℃；進樣量 2 L；流速0.3 mL/min；流動相：A為0.05%乙酸水溶液，B為乙腈；梯度程序：0 min，5%B；2 min，5%B；10 min，30%B；20 min，100%B。25 min處停止并繼續運行4 min。

質譜條件：電噴霧離子源采用正/負離子源模式；干燥氣溫度300℃；干燥氣流速6L/min；鞘氣溫度350℃；鞘氣流速11 L/min；霧化器壓力35 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛細管電壓3.5 kV；噴嘴電壓1 kV；質量掃描范圍m/z 100～1 000；采集模式 Full scan，Auto MS/MS。

1.4 結構鑒定

應用Masshunter工作站中的Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.07.00、Masshunter PCDL Manager B.07.00和Agilent Masshunter Molecular Structure Correlator軟件處理樣品的原始質譜數據，確定每個峰的保留時間、m/z、MS/MS碎片離子，并計算對應的分子式和偏差。根據化合物的保留時間、分子式、m/z、MS/MS碎片離子等信息，并結合參考文獻和數據庫TCM Database@Taiwa（http：//tcm.cmu.edu.tw/）、Metlin（https：//metlin.scripps.edu）、Chemspider（https：//www.chemspider.com/）和 PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）對化合物的結構進行初步鑒定。采用ChemDraw軟件繪制化合物的結構圖和裂解規律圖，采用Origin繪制樣品的總離子流圖。

2 結果與分析

樣品經UPLC-Q-TOF-MS分析，正/負離子模式下的總離子流圖見圖1～圖2。

圖1 茶樹槲寄生總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Viscum coloratum（Kom.）Nakai hosted by Camellia assamica（Mast.）Chang in ion modes

圖2 梨樹槲寄生總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of Viscum coloratum（Kom.）Nakai hosted by Pyrus，i，f.in ion modes

鑒定出的酚類和萜類化合物的保留時間、m/z、MS/MS碎片離子等信息見表1。

表1 UPLC-Q-TOF-MS在正/負離子模式下鑒定茶樹、梨樹槲寄生中的酚類和萜類化合物Table 1 Phenolic and terpenoid compounds identifified in Viscum coloratum（Kom.）Nakai hosted by Camellia assamica（Mast.）Chang and Pyrus，i，f. by UPLC-Q-TOF-MS in both negative and

根據化合物保留時間、分子式、m/z、MS/MS碎片離子等信息，并結合數據庫和參考文獻從槲寄生中共鑒定出36種化合物。其中酚類化合物有17種，包括2種酚酸（甲基β-間苯二酚和間香豆酸），11種類黃酮化合物（薔薇苷B、新圣草苷、橙皮素7-O-葡萄糖苷、山奈酚、山姜素、對香豆酰基三乙酸內酯、高良姜素、山奈酚-3-甲醚、6-5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基-8-甲基異黃酮-5-新橙皮苷、喬松素和橘皮素），2種木脂素（鬼臼內酯苷和云南擬單性木蘭素A）和2種香豆素（Libanorin和Heliettin）；萜類化合物有 19種，包括1種半萜（青蒿酸甲酯），3種單萜（黑麥草內酯、吐葉醇和氧化芳樟酯），3種倍半萜（青蒿甲素I、4-hydroxy-3-methoxy-2，10-bisaboladien-9-one和蜜環菌辛素），2種二萜（丹參新酮II和羅漢松內酯E），6種三萜（靈芝醇F、漫五酸、靈芝醇B、靈芝醇D、野鴉椿酸甲酯和松葉菊萜酸）和4種環烯醚萜（乙酰基梓醇、狹葉獐牙菜甙、杜仲醇和繡球茜草辛苷）。其中，兩種槲寄生中含有9種相同的化合物。本試驗在茶樹、梨樹槲寄生中新鑒定的化合物包括茶樹槲寄生中甲基β-間苯二酚、薔薇苷B和乙酰基梓醇3種酚類化合物，青蒿酸甲酯和松葉菊萜酸2種萜類化合物；梨樹槲寄生中甲基β-間苯二酚、山姜素、云南擬單性木蘭素A和鬼臼內酯苷4種酚類化合物，狹葉獐牙菜甙、青蒿甲素I和青蒿酸甲酯3種萜類化合物。

茶樹、梨樹槲寄生中含有豐富的酚類和萜類化合物，其中喬松素因其具有較好的抗炎和抗氧化活性，能夠對腸缺血再灌注小鼠的腸黏膜和對乙酰氨基酚誘發的小鼠肝損傷發揮保護作用[8-9]；能夠增加神經元的活性和谷胱甘肽的水平、降低乳酸脫氫酶的活性、抑制一氧化氮和活性氧的產生，具有一定的神經保護作用[10]；同時喬松素可保護體外培養的大鼠腦微血管內皮細胞免受氧-葡萄糖剝奪/再氧化的損傷，并能夠增加線粒體膜電位，表明喬松素對體外血腦脊液屏障具有一定的保護作用[11]。

山姜素可通過減少炎癥和氧化應激反應，改善膿毒癥大鼠的急性肺損傷以及冠心病大鼠的心臟功能、血脂和血管內皮功能[12-13]；可以通過減輕子宮的組織學病變和降低髓過氧化物酶的活性，保護小鼠免受子宮內膜炎侵害[14]；能夠抑制腎組織中腫瘤壞死因子和白細胞介素等炎癥因子的產生以及核轉錄因子的活化，減輕腎臟損傷[15]；可通過抑制軟骨細胞中炎癥因子的表達保護脂多糖誘導的軟骨細胞，促進軟骨細胞增殖，能有效預防骨關節炎[16]。除此之外，山姜素具有一定的抑制腫瘤細胞增殖作用，是抗癌抗腫瘤研究的熱點藥物之一，可抑制膠質瘤干細胞的增殖和侵襲[17]；在SKOV3卵巢癌細胞系中以劑量和時間依賴方式抑制SKOV3細胞的集落和球體形成，并誘導其凋亡[18]；同時還可通過調節PI3/KAKT信號通路抑制肺癌的發展，并通過線粒體途徑抑制胃癌細胞增長[19]。

橘皮素能有效緩解高強度運動誘發的人體皮質醇應激反應，抑制皮質醇過度分泌，提升人體抗氧化能力，加速體內炎癥消除，促進身體機能的恢復[20]；可通過增強胰島素的分泌調節肝酶活性，并能夠降低血糖，從而達到預防糖尿病的作用[21]；同時橘皮素能夠通過抑制神經系統、消化系統和泌尿系統相關細胞中的NF-κB通路發揮其抗炎功能，以及通過部分調節Nrf2信號通路降低肝臟中的氧化應激，進而緩解非酒精性脂肪性肝病[22]；除此之外橘皮素對雙酚A誘導的氧化應激具有極好的改善作用，可降低雙酚A誘導引起的肝臟損傷[23]。

山奈酚具有促進人體健康，預防多種疾病的功能。山奈酚可通過誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞黏附、遷移和侵襲等方式發揮其抗癌功效[24]；能夠通過線粒體途徑和內質網應激途徑誘導HepG2細胞凋亡，具有潛在的抗肝癌活性，對癌癥及心血管疾病具有一定的預防作用[25-26]。山奈酚能夠通過調節炎癥相關蛋白的表達以及抑制轉錄因子激活等方式，抑制炎癥的發生和發展[24]；可抑制TLR4-NF-κB-NLRP3炎癥信號通路，減少機體中炎癥因子的合成與釋放，增加抗炎因子的轉錄活性，能夠保護腸黏膜機械屏障的完整，降低結腸的病理性損傷，減輕由葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎[27]。此外，山奈酚可以通過改善胰島素敏感指數，增加胰島素敏感性，發揮對糖尿病的防治功效[24]。

高良姜素能夠清除氧自由基、減輕心肌細胞氧化脂質化，并通過抑制轉錄因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素等炎癥因子的表達，可抑制心肌細胞的肥大和死亡[28]；同時高良姜素可調節磷酸肌醇激酶和糖原合成酶激酶信號通路，降低心肌細胞凋亡，上調抗凋亡蛋白、降低凋亡蛋白基因表達，延緩心肌細胞過度損傷導致的纖維化[29]；此外高良姜素能下調轉化生長因子、纖維連接蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、基質金屬蛋白酶的活性，進而抑制心肌纖維化發生，同時調節絲裂原活化蛋白激酶，能夠顯著改善心臟收縮及舒張功能[30]。

綜上所述，茶樹、梨樹槲寄生中的酚類和萜類化合物具有較好的生物活性，能夠預防多種疾病和促進人體健康，可為茶樹、梨樹槲寄生在功能食品中的應用提供科學依據。

3 結論

本試驗采用UPLC-Q-TOFMS法從茶樹、梨樹槲寄生中共鑒定出36種化合物，包括17種酚類化合物和19種萜類化合物。茶樹槲寄生中鑒定出8種酚類化合物和11種萜類化合物，梨樹槲寄生中鑒定出13種酚類化合物和13種萜類化合物，兩種槲寄生含有9種相同的化合物。其中，新鑒定的化合物包括茶樹槲寄生中甲基β-間苯二酚、薔薇苷B和乙酰基梓醇3種酚類化合物，茶樹槲寄生中青蒿酸甲酯和松葉菊萜酸2種萜類化合物；化合物甲基β-間苯二酚、鬼臼內酯苷、山姜素和云南擬單性木蘭素A為梨樹槲寄生中鑒定出的4種酚類化合物，化合物狹葉獐牙菜甙、青蒿甲素I和青蒿酸甲酯為梨樹槲寄生中鑒定出的3種萜類化合物。說明茶樹、梨樹槲寄生中含有豐富的酚類和萜類化合物，可為茶樹、梨樹槲寄生的開發利用提供科學依據。