基于氣相色譜檢測法研究椪柑酒中甲醇、雜醇油的生成規律

湛佳佳，張香，胡亞平，2，張志旭，周柄屹，周泉，秦丹，2*，曾璐*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省發酵食品工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；4.湖南農業大學國家中醫藥管理局亞健康干預技術實驗室，湖南 長沙 410128；5.天下果業開發有限公司，湖南 吉首 416000）

椪柑（Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan）又名蘆柑，屬于蕓香科柑橘屬植物果實,富含氨基酸、維生素C、礦物質等營養元素，以及酚類、類黃酮、胡蘿卜素等生物活性物質，是一種營養價值較高的水果[1]。椪柑酒是以椪柑為原料，取汁后，經發酵、陳釀、澄清后得到的低酒精度果酒[2]，保留了原料中的多種活性成分，適量飲用有益于身體健康[3-5]。但在主發酵過程中，椪柑原料的果膠物質極易被轉化生成甲醇、雜醇油等副產物[6-7]。其中，甲醇對人體可產生麻醉作用，超過5 g會出現嚴重中毒，超過12.5 g就可能導致死亡[8-9]。雜醇油的種類較多，主要有正丙醇、異丁醇、異戊醇，在酒體中的含量分別是甲醇的3.5、8、19倍[10-12]，含量過高會使酒體產生異雜味[13]，且毒性較大，易使人產生頭部神經疼痛、面紅耳赤、頭暈心跳、惡心嘔吐等現象，危害人體健康[14]。然而，目前除了在GB 15037—2006《葡萄酒》中對白、桃紅葡萄酒的甲醇含量有<250 mg/L的規定外，其他果酒尚缺失相關標準，對其甲醇、雜醇油的含量未有統一規定。所以在釀造過程中對果酒中甲醇和雜醇油進行調控和測定顯得十分重要。現階段常用的測定方法主要是比色法[15-16]，但操作繁瑣、耗時較長，難以快速及時地了解甲醇和雜醇油的含量變化情況。也有研究采用氣相色譜法對果酒中甲醇和雜醇油進行測定，具有操作簡單、靈敏度高、檢測限高等優點，物質完全分離需要24 min左右[17-19]。本文采用氣相色譜法對主發酵期間椪柑酒中甲醇和雜醇油含量進行檢測，以期為椪柑酒的品質調控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吉品椪柑：市售，產自湖南湘西自治州；葡萄酒果酒酵母SY：安琪酵母股份有限公司；蔗糖：柳州市古麗冰糖有限公司；甲醇（色譜純）、正丙醇（色譜純）、異丁醇（色譜純）、異戊醇（色譜純）、乙醇（色譜純）、4-甲基-2-戊醇（色譜純）：南京化學試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設備

廚房機械原汁機（JYZ-E8）：九陽股份有限公司；型生化培養箱（MJ-250B5-Ⅱ）：上海新苗醫療器械制造有限公司；氣相色譜儀（GC-2010plus）：日本島津公司。

1.3 椪柑酒的生產工藝

1.4 色譜條件

色譜柱：DB-WAX石英毛細管柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）；進樣口溫度250℃；檢測器溫度250℃；H2流量47 mL/min，空氣流量400 mL/min；尾吹速率30 mL/min；載氣 N2，流量 2.8 mL/min，分流比 50∶1。

升溫程序：初溫45℃，恒溫3 min；以5℃/min升至70℃，恒溫2 min；以15℃/min升至130℃，恒溫2 min；以40℃/min升至200℃，恒溫2 min。

1.5 椪柑酒中甲醇、雜醇油含量的測定

1.5.1 溶液配制

單一標準品溶液：準確吸取甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇2.00 mL分別于100 mL容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

內標溶液：準確吸取2mL4-甲基-2-戊醇于100mL的容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

甲醇及雜醇油混合標準母液：準確吸取甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇2.00 mL于100 mL容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

甲醇及雜醇油混合標準溶液：準確吸取上述混合標準母液2 mL和內標溶液2 mL于100 mL容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

1.5.2 標準曲線的繪制

分別向5個10 mL容量瓶中加入0.2 mL 20 g/L的4-甲基-2-戊醇（內標物）溶液，再分別加入0.1、0.5、1.0、3.0、5.0 mL混合標準母液，均用40%乙醇水溶液定容。以醇和內標物的質量濃度之比為橫坐標，醇和內標物的峰面積之比為縱坐標，繪制甲醇和雜醇油的標準曲線圖。定量限為信噪比的10倍。

1.5.3 甲醇、雜醇油的定性

分別吸取單一標準品溶液各進樣1 μL，得到甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇的保留時間，再吸取混合標準溶液進樣1 μL，以單一標準品溶液和混合標準溶液的出峰時間為對照進行定性，得到甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、4-甲基-2-戊醇的色譜圖。

1.5.4 氣相色譜檢測樣品準備

參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行試樣制備。吸取100 mL試樣于500 mL蒸餾瓶中，加入100 mL水和幾顆玻璃珠，緩慢加熱蒸餾，收集餾出液，吸取10 mL餾出液于試管中，加入0.10 mL 4-甲基-2-戊醇標準溶液，混勻，備用。

1.5.5 精密度與重復性分析試驗

取同一標準溶液連續進樣5次，計算峰面積的相對標準偏差（relative standard deviatio，RSD），以考察儀器的精密度；取同一酒樣，平行測定5次，計算甲醇和雜醇油含量的RSD值，以考察重復性。

1.5.6 穩定性分析試驗

取同一椪柑酒樣品，分別于0、4、8、12 h進樣測定，記錄色譜圖峰面積，計算RSD。

1.5.7 加標回收率分析試驗

取2 mL內標溶液于100 mL容量瓶，用椪柑酒定容，測定甲醇、雜醇油含量。分別取2 mL內標溶液和混合標準溶液，用同一酒樣定容至100 mL，記錄色譜圖峰面積，計算甲醇、雜醇油回收率。

1.6 數據統計與分析

應用Excel和SPSS軟件進行統計和方差分析，使用Origin 2019軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 椪柑酒中甲醇和雜醇油同步檢測法的建立

椪柑酒樣品及標準品甲醇、雜醇油的氣相色譜見圖1。

圖1 標準溶液及椪柑酒樣品溶液中甲醇、雜醇油的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatograms of methanol and fusel oil in standard solution and citrus wine sample solution

由圖1可知，該方法可使甲醇、雜醇油在13 min內完全分離。

2.2 單一醇的線性考察及定量限

甲醇、雜醇油的回歸方程和定量限見表1。

表1 甲醇、雜醇油的回歸方程和定量限Table 1 Regression equation and quantification limit of methanol and fusel oil

由表1可知，在20mg/L～1000mg/L質量濃度范圍內，甲醇及雜醇油的峰面積之比和濃度之比均具有較好的線性關系，且相關系數均大于0.9990。因此，該方法能夠精確地測定甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇的含量。

2.3 精密度和重復性試驗

精密度和重復性試驗結果見表2和表3。

表2 精密度試驗結果Table 2 Precision test results

表3 重復性試驗結果Table 3 Repeatability test results

由表2可知，同一標準溶液連續進樣5次，甲醇、雜醇油標準溶液的相對標準偏差（RSD）分別為2.24%、1.64%、1.78%、0.91%，表明儀器精密度良好。如表3所示，對同一椪柑酒平行測定5次，樣品中甲醇、雜醇油的RSD分別為2.40%、3.55%、3.64%、2.86%，表明該方法的測定值重復性良好。

2.4 穩定性試驗

穩定性試驗結果見表4。

表4 穩定性試驗結果Table 4 Stability test results

由表4可知，分別在4個時間點測定椪柑酒中甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇。其峰面積RSD為1.93%～2.60%，表明該方法在12 h內的測定值穩定性良好。

2.5 加標回收率試驗。

加標回收率結果見表5。

表5 加標回收率試驗結果Table 5 Results of spike and recovery test

由表5可知，在已知濃度的溶液中加入甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇標準溶液進行測定，根據色譜圖峰面積計算回收率。椪柑酒中甲醇和雜醇油正丙醇、異丁醇、異戊醇的加標回收率在96.29%～103.36%之間，RSD分別為0.18%、0.16%、0.12%、0.06%，回收率較高且穩定，說明該方法準確可靠，可用于椪柑酒中甲醇和雜醇油的測定。

2.6 椪柑酒主發酵過程中酒精度和殘糖變化規律

椪柑酒主發酵期間酒精度和殘糖含量的變化結果見圖2。

圖2 主發酵期間酒精度和殘糖含量的變化Fig.2 Changes in the content of alcohol and residual sugar during main fermentation

由圖2可知，主發酵過程中隨著發酵時間的延長，總糖逐漸被酵母菌分解消耗，第2天總糖的消耗速率最快，酒精度迅速升高。說明這期間酵母菌的代謝活動最旺盛，6 d后酒精度逐漸趨于平緩，9 d后殘糖含量和酒精度基本不變，表明發酵過程已基本完成。

2.7 椪柑酒主發酵過程中甲醇和雜醇油生成規律

甲醇和雜醇油的生成規律見圖3、圖4。

圖3 主發酵期間甲醇含量變化Fig.3 Changes in the content of methanol during main fermentation

由圖3可知，主發酵期間椪柑酒甲醇含量隨著發酵時間的延長逐漸升高，前5天甲醇含量增長速度較快，第6～9天增長速度緩慢，在第8天甲醇含量達到峰值[（261.14±5.58）mg/L]后趨于穩定。主要是因為果膠在果膠酶作用下水解生成甲醇，由于前期果膠酶活力旺盛，隨著主發酵的進行，可迅速分解發酵體系中的果膠物質，導致主發酵后期果膠含量減少，使得甲醇的生成量也逐漸降低[20]。

由圖4可知，主發酵期間前4 d正丙醇、異戊醇、異丁醇含量增長速度較快，分別在第9、11、8天達到峰值[（171.40±3.69）、（390.29±11.80）、（44.07±0.97）mg/L]。主發酵期間椪柑酒中的主要雜醇油的含量由高到低依次為異戊醇、正丙醇、異丁醇，其中異戊醇是椪柑酒中主要雜醇，占雜醇油總質量的70.99%。

3 結論

本試驗所采用的氣相色譜檢測方法能使甲醇、雜醇油在13min內完全分離，可在短時間內同步測定甲醇、雜醇油的含量。測定結果表明：主發酵期間椪柑酒中甲醇、正丙醇、異戊醇、異丁醇的含量均呈先升高后趨于穩定的規律，分別在第8、9、11、8天達到峰值[（261.14±5.58）、（171.40±3.69）、（390.29±11.80）、（44.07±0.97）mg/L]，其中甲醇含量超出國家標準規定的250 mg/L限定值，表明該酒樣還需進行發酵優化或陳釀處理。本試驗結果可為椪柑酒中甲醇、雜醇油含量檢測提供有效方法，同時為后續果酒品質優化提供研究方向。