NLRP3炎癥小體激活促進肝星狀細胞活化的機制

彭 憬，袁 維，銀思涵，孫克偉

湖南中醫藥大學第一附屬醫院 肝病科，長沙 410007

肝纖維化是一系列慢性肝損傷的病理生理結果，是一個涉及實質細胞(肝細胞)、肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)、肝竇內皮細胞以及常駐和浸潤免疫細胞之間相互作用的動態過程，細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的過度積累則是其最突出的特征[1]。HSC位于肝竇內皮細胞和肝細胞之間的竇周隙，主要在胞漿的脂滴中儲存類視黃醇(維生素A)。激活后的HSC失去儲存類視黃醇的能力，開始增殖、收縮和分泌ECM主要成分膠原Ⅰ和Ⅲ[2]。肝竇內皮細胞上的窗孔會被HSC形成的基底膜封閉，造成肝竇毛細血管化，影響血竇與肝細胞之間物質交換[3]。近年研究發現，NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體可在肝細胞[4]、HSC[5]、肝巨噬細胞[6]等多種細胞內表達，除介導HSC的激活外，還通過釋放的下游炎癥因子和引起細胞焦亡放大肝臟內炎癥反應，形成惡性循環加重肝臟損傷和纖維化。

NLRP3是三元蛋白質，包含一個氨基端吡啉結構域(PYD)，一個中央NACHT結構域(NAIP、CIITA、HETE和TP1)和一個羧基端富含亮氨酸重復序列(LRR)結構域。在炎癥小體復合物組裝過程中，作為接頭蛋白的凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)N端通過PYD-PYD與NLRP3連接。ASC的C端有一個caspase募集結構域(CARD)，通過CARD-CARD相互作用與procaspase-1結合，促進后者二聚化和激活。隨后以caspase-1依賴的方式，釋放炎性介質IL-1β和IL-18(圖1)。NLRP3炎癥小體作為胞漿內蛋白感受器，目前認為它的激活分兩步：首先由LPS、TNFα等啟動NLRP3和pro-IL-1β表達，接著被K+外流、Ca2+內流、線粒體功能紊亂、細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)等胞內損傷信號激活[7-8]。影響HSC活化的因素如IL-1、TNF、ROS等[2]也能激活NLRP3炎癥小體，提示后者可能參與了HSC活化。基于NLRP3 炎癥小體激活在肝纖維化中的重要作用，NLRP3有望成為臨床治療的新靶點。

注：微生物組成部分和內源性損傷因子提供啟動信號，導致關鍵轉錄因子NF-κB激活，隨后上調NLRP3和pro-IL-1β表達。細胞外ATP、K+外流、Ca2+內流、ROS的產生、溶酶體損傷、顆粒物質等激活NLRP3炎癥小體。dsRNA，雙鏈RNA；TLR4，Toll樣受體4；ROS，活性氧；Ox-mtDNA，氧化線粒體DNA；TXNIP，硫氧還蛋白互作蛋白；TWIK2，弱內向整流二孔K+通道2；TRPM2，瞬時受體電位M2通道；P2X7R，嘌呤能離子通道型受體7；MAVS，線粒體抗病毒信號蛋白；CLIC，胞內氯離子通道。

1 介導HSC內不同通路

活化的HSC是肝纖維化過程的關鍵細胞，研究發現NLRP3炎癥小體可通過多條通路激活HSC(圖2)，促進其α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和膠原等激活標志的表達，引起肝纖維化。

注：NF-κB，核因子κB；MyD88，髓樣分化因子88；MAPK，絲裂原活化蛋白激酶；Dectin-1，樹突狀細胞相關C型凝集素-1；ERβ，雌激素受體β；ASK1，凋亡信號調節激酶1；Syk脾酪氨酸激酶；SEA，日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原；p66Shc，66 kDa原癌基因Src膠原同源物(Shc)銜接蛋白。

1.1 TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信號通路 用LPS刺激HSC上TLR4，能活化下游NF-κB炎癥信號通路[9]，而NF-κB作為關鍵轉錄因子，能提供啟動信號，上調NLRP3和pro-IL-1β表達。棕櫚酸(PA)通過刺激TLR4/NF-κB信號通路，激活HSC中的NLRP3炎癥小體并向纖維化表型轉變。另外被此信號通路激活的NLRP3炎癥小體，加劇了高脂肪飲食喂養的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)大鼠向肝纖維化的轉變[10]。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)通過 TLR4/MyD88/NF-κB通路促進NLRP3和pro-IL-1β的表達，促進HSC的激活。此外，IL-1β還能協助Ang Ⅱ增加TLR4、MyD88和Ⅰ型膠原Α1(collagen type Ⅰ alpha 1,Col1a1)蛋白水平的表達[11]。TLR4模式識別受體是固有免疫識別各種病原體的重要組成部分，能識別多種內源性和外源性配體，刺激表達在HSC上的TLR4使其活化，可能在多種肝臟疾病纖維化進展中發揮重要作用。

1.2 嘌呤能離子通道型受體7(P2X7R)/NLRP3信號通路 P2X7R能被受損細胞釋放的ATP激活，在NLRP3炎癥小體激活的第二信號中起關鍵作用。在LPS/ATP雙重信號刺激下，LX-2 細胞(人肝星形細胞系)中NLRP3炎癥小體各組成部分顯著上調，用選擇性P2X7R拮抗劑A438079或P2RX7 siRNA能抑制HSC中NLRP3炎癥小體的表達和ECM的合成與沉積[12]。P2X7R的過表達還降低了LX-2細胞激活的閾值[13]。乙醇主要在肝細胞中代謝，但過量的乙醇積累能損傷肝細胞，使其釋放ATP[14]。一項研究[15]顯示在慢性酒精性肝纖維化和急性酒精性肝損傷小鼠模型中，P2X7R及相關基因的表達均上調，HSC內此通路的激活還可以使其自分泌IL-6、TNFα等炎癥因子以及激活靜止HSC成為肌成纖維細胞的TGFβ。這顯示在酒精性肝病中，肝細胞與HSC之間的相互作用除能通過P2X7R直接激活HSC外，還可以介導炎癥，在纖維化的發展中具有重要作用。

1.3 硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)/NLRP3信號通路 在靜息狀態下，TXNIP與其配體結合并使其處于非活性狀態。當細胞氧化應激時，被誘導產生的ROS觸發TXNIP與硫氧還原蛋白解離，結合并激活NLRP3炎癥小體[16]。TXNIP的敲低抑制HSC激活，而TXNIP過表達則增強HSC激活，并且這種方式是通過HSC內氧化應激調控的[17]。在日本血吸蟲誘導的肝臟肉芽腫和肝纖維化小鼠模型中，肝臟組織中TXNIP的表達水平增加，并與NLRP3炎癥小體相互作用，促進HSC α-SMA和膠原Ⅰ和Ⅲ表達增加[18]。TXNIP與HSC內氧化應激水平密切相關，許多有害刺激都能引起細胞氧化應激，TXNIP作為廣泛表達的蛋白，研究其在HSC激活中作用的文獻較少，有待進一步深入。

1.4 p66Shc/mito-ROS/NLRP3信號通路 p66Shc(Shc的66 kDa蛋白亞型)是線粒體活性氧(mito-ROS)產生的主要調節因子，是肝細胞氧化應激的關鍵介質。應激刺激后，在胞漿中激活并磷酸化的p66Shc轉移到線粒體膜間隙，結合并氧化細胞色素c產生大量的mito-ROS[19]。p66Shc基因的敲低使HSC超氧化物歧化酶表達和活性顯著增加，以及H2O2、mito-ROS水平和線粒體細胞色素c釋放急劇減少，維持線粒體膜正常電位，改善TGFβ1引起的氧化應激，此外NLRP3炎癥小體復合物組成部分表達也下調。p66Shc過度表達使HSC中激活標志物如結締組織生長因子(CTGF)、α-SMA、Col1a1和基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP1)表達增加，通過NLRP3的敲低則會減弱這種效果[20]。mito-ROS占細胞內ROS絕大部分來源，因此在氧化應激中p66Shc可能通過促進mito-ROS形成介導HSC活化。

1.5 E2/雌激素受體β(ERβ)/MAPK/NLRP3信號通路 ERβ激動劑二芳基丙腈(DPN)能抑制HSC活化，以及血小板衍生生長因子誘導的HSC增殖[21]。TGFβ能減少ERβ在HSC細胞膜上的表達，并且ERβ的選擇性抑制劑四氯乙烯(THC)增強了NLRP3的激活[22]。在H2O2誘導的HSC-T6細胞氧化應激中，三個MAPK蛋白(p-ERK、p-JNK和p-p38)磷酸化顯著增加，雌二醇(E2)處理組能下調它們的表達，THC則能完全抑制E2的作用，而ERα選擇性抑制劑甲基哌啶吡唑(MPP)卻無此效果[23]。綜上所述，說明E2主要通過ERβ發揮抑制肝纖維化的作用。這可能也解釋了在絕經前，同齡的女性肝纖維化程度較輕，而絕經后這一保護作用卻消失[24]。

1.6 Dectin-1/Syk/NLRP3信號通路 樹突狀細胞相關C型凝集素-1(DC-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是細胞膜蛋白，可依賴其下游信號脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)誘導ROS的產生，觸發NLRP3炎癥小體組裝[25]。用Dectin-1阻滯劑預處理小鼠HSC，阻止了日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)誘導的caspase-1和IL-1β的產生。Syk基因的沉默則抑制了NLRP3和caspase-1在HSC中的聚集[26]，考慮到Syk能使ASC第146 和第187位酪氨酸殘基磷酸化，這一過程能增強ASC寡聚化并招募procaspase-1[27]，推測上述實驗結果可能是Syk可與作為接頭的ASC直接結合，促進炎癥小體復合物形成有關。NLRP3基因的沉默顯著抑制SEA刺激小鼠HSC向纖維化表型改變[26],提示Syk可通過ROS的產生和直接促進炎癥小體復合物的形成，在此通路中發揮關鍵作用。

1.7 ASK1/JNK/NLRP3信號通路 ASK1能被ROS、LPS、細胞因子等各種刺激活化，隨后磷酸化JNK[28]，而p-JNK可以使NLRP3第194位絲氨酸磷酸化(人是198位)，促進NLRP3炎癥小體的自結合和激活[29]。ASK1/JNK通路能促進HSC增殖和活化，加重大鼠肝纖維化和炎癥反應[28]。在他莫昔芬誘導激活的NLRP3突變體敲入(Nlrp3-KI)小鼠，口服ASK1抑制劑GS-444217能降低肝組織磷酸化ASK1、c-Jun的表達，抑制肝細胞的死亡和肝纖維化。Nlrp3-KI小鼠分離的Kupffer細胞中促炎基因TNFα、IL-1β及HSC中促纖維化基因Col1a1、肌動蛋白α2的表達增強，而ASK1的抑制能使上述基因的表達減弱[30]。在一項多中心二期臨床實驗，ASK1選擇性抑制劑selonsertib能改善NASH患者2期或3期肝纖維化和肝小葉炎癥[31]，顯示此通路的激活與肝臟炎癥反應和纖維化密切相關。

2 促進炎癥微環境形成

肝臟炎癥微環境由Kupffer細胞、浸潤的巨噬細胞、T淋巴細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞及其分泌的炎性介質構成。而其中巨噬細胞在促進HSC活化中至關重要，激活后不僅能分泌炎癥因子[32]，作為CXCL2的主要來源，還能募集中性粒細胞[33]。而NLRP3炎癥小體的激活能促進肝臟炎癥微環境的形成，進而使HSC活化。

2.1 肝臟巨噬細胞 與HSC中NLRP3炎癥小體的激活會誘導其向纖維化表型轉變不同，巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的激活可使大量炎癥因子釋放到胞外，進而促進HSC活化。在膽石酸(LCA)+Nigericin刺激下，Kupffer細胞內ROS的增加能激活NLRP3炎癥小體，使得M1表型標志Tnf、iNos表達增加，M2表型標志Arg1表達下調[34]。而應用NLRP3的抑制劑MCC950，使肝臟極化巨噬細胞向M2型轉變[35]，以上實驗提示在巨噬細胞向促炎性表型轉換中，NLRP3炎癥小體的激活起重要作用。M1型巨噬細胞分泌的TNFα[36]、IL-6[37]等炎癥因子可促進HSC的激活，而分泌的IL-1β作用于HSC上的P2X7R，可以使其維持在激活狀態[13]。不同于前述巨噬細胞內NLRP3炎癥小體的激活促進HSC活化，巨噬細胞分泌的CXCL2可以作用于LX-2細胞上受體CXCR2，介導HSC內NLRP3炎癥小體激活使其活化[38]。

2.2 中性粒細胞 NLRP3炎癥小體在轉基因小鼠體內的激活，可以上調中性粒細胞關鍵趨化因子CXCL1(20倍)和CXCL2(30倍)的mRNA表達[39]。NLRP3基因敲除的小鼠肝臟髓過氧化物酶(MPO)+細胞(中性粒細胞)滲入減少[34]，表明NLRP3炎癥小體的激活可募集中性粒細胞到肝臟，加重炎癥反應。HSC可被募集到肝臟的中性粒細胞，產生的ROS激活，并分泌粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和IL-15，延長中性粒細胞的生存[40]，提示中性粒細胞與HSC之間存在正反饋回路，促進肝臟損傷和纖維化。

2.3 IL-1β和IL-18 NLRP3炎癥小體下游信號IL-1β和IL-18也可以介導炎癥反應，但IL-1β還能與HSC相互作用促進其激活。IL-1β介導TGFβ以自分泌方式在LX-2細胞表達[41]，造成ECM沉積和NLRP3炎癥小體活化的第二信號如P2X7R激活及Ca2+內流增加[13]，顯示存在正反饋環路促進HSC的激活。用IL-1β受體阻滯劑rIL-1Ra預處理HSC-T6細胞，E.coli RNA誘導產生的TGFβ1的分泌明顯降低，細胞內α-SMA、COL1A1和TIMP-1的mRNA表達被顯著抑制[42]。上述研究發現IL-1β能影響HSC的TGFβ分泌和活化，其機制在于IL-1β能活化NF-κB亞基p65和轉錄激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)亞基c-Jun，分別結合到TGFβ啟動子κB3和AP-1-3位點，提高組蛋白H4和H3乙?；剑技疪NA聚合酶Ⅱ啟動TGFβ基因轉錄[43]。此外IL-1β還能通過JNK/AP-1通路誘導體外培養的HSC增殖，但在小鼠體內卻不明顯[44-45]。

3 總結與展望

NLRP3炎癥小體在多種肝臟疾病中都可表達，與疾病的嚴重程度相關[4,46]，可作為肝組織炎癥和損傷的檢測指標。NLRP3炎癥小體通過HSC內氧化應激、炎性信號等，促進由巨噬細胞、中性粒細胞、IL-1β等構成的炎癥微環境的形成，從而形成錯綜復雜的網絡使HSC活化。

盡管上述眾多研究表明NLRP3與HSC的活化相關，但研制針對肝纖維化的NLRP3抑制劑較少，例如NT-0167(MCC950衍生物)應用于肝纖維化仍處于臨床前研究，療效尚不清楚[47]。MCC950能非競爭性抑制碳酸酐酶2活性，造成脫靶[48]，這也限制了MCC950及其衍生物在臨床上的應用。由于NLRP3炎性小體有復雜的信號級聯放大效應，可以使用多種靶點來抑制NLRP3炎癥小體。在個案報道中，用秋水仙堿常規治療地中海熱的基礎上聯合IL-1β中和抗體canakinumab，可使進展為NASH的患者轉氨酶降為正常，顯著改善肝纖維化[49]，顯示了積極的抗肝纖維化效果。但由于對NLRP3阻滯劑作用機制的理解不足，以及這些分子的潛在脫靶效應限制了它們進一步的臨床應用，選擇NLRP3分子特異結構設計藥物和提高對HSC的靶向性將是有意義的探索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：彭憬、孫克偉參與起草和修改文章關鍵內容；袁維、銀思涵對研究的思路有關鍵貢獻。