肝細胞癌腫瘤免疫微環境中T淋巴細胞的功能與調控機制

韓孟奎，李 晉，楊小華

1 蘇州大學附屬第一醫院 普通外科，江蘇 蘇州 215031；2 蘇州市第五人民醫院 檢驗中心，江蘇 蘇州 215131

肝細胞癌(HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，占原發性肝癌的75%～85%[1]。在肝癌早期階段，肝切除或肝移植是標準治療手段，術后5年生存率可達70%；而對于多數失去手術機會的晚期患者，盡管采取局部消融、放療和分子靶向治療等非手術療法，肝癌的5年總體生存率僅為18%[2]。近年來，隨著對腫瘤免疫微環境(tumor immune microenvironment，TIME)研究的不斷深入，腫瘤免疫治療相關研究和臨床實驗取得較大進展，HCC晚期患者的非手術治療有了更多選擇。TIME主要由免疫細胞、基質細胞、細胞因子和物理成分等組成，其中T淋巴細胞作為主要的免疫細胞，在TIME調控中發揮腫瘤清除、細胞因子分泌等多重效應[3]。本文對參與肝癌TIME中T淋巴細胞功能調控的關鍵免疫細胞和信號通路的研究現狀及進展進行綜述，為進一步研究TIME免疫調控反應對HCC發生發展的作用以及未來肝癌免疫治療策略提供理論依據。

1 TIME中主要T淋巴細胞亞型及作用機制

T淋巴細胞作為TIME中的關鍵免疫細胞，其中CD8+T、CD4+T、調節性T淋巴細胞(Treg)等亞群在肝癌發生發展、免疫治療等領域受到廣泛關注。CD8+T淋巴細胞是腫瘤研究領域最受關注的T淋巴細胞亞群。研究[4]表明，HCC腫瘤組織中CD8+T淋巴細胞可分化為細胞毒性T淋巴細胞，繼而產生細胞因子和細胞毒性酶(穿孔素、顆粒酶B)從而清除癌細胞并可發展為記憶T淋巴細胞。也有研究[5-6]指出腫瘤組織中高浸潤CD8+T淋巴細胞提示HCC患者高復發率和預后不良，其機制可能是在長期抑制性TIME的背景下，腫瘤特異性CD8+T淋巴細胞容易進入“T淋巴細胞耗竭”階段，表現為淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)、細胞毒性T淋巴細胞蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、T淋巴細胞免疫球蛋白3(T cell immunoglobulin-3，TIM-3)等細胞表面抑制性受體表達增加，細胞因子如IL-2、TNFα、IFNγ的產生和腫瘤殺傷能力受損。綜上可知，浸潤的CD8+T淋巴細胞能夠通過增強機體抗腫瘤免疫功能，緩解或控制腫瘤的進程，與HCC良好的預后相關。

除CD8+T淋巴細胞外，CD4+T淋巴細胞也被證明在控制腫瘤進展中發揮重要作用。研究[7]表明，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型中，誘導CD4+T淋巴細胞凋亡可以促進HCC的發生。首先，CD4+T淋巴細胞能通過分泌細胞因子和激活CD8+T淋巴細胞從而發揮免疫功能。同時，幼稚CD4+T淋巴細胞可在特定細胞因子誘導下表達T-bet、GATA-3和Bcl6等轉錄因子，進而分化為Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh等多種亞群[8]。此外，在抗腫瘤反應中也可檢測到具有細胞毒性的CD4+T淋巴細胞，提示這些細胞可能在體內表現出與CD8+T淋巴細胞互補的功能，共同發揮抗腫瘤效應[9]。綜上所述，腫瘤組織中CD4+T浸潤減少或功能受損能夠引起CD8+T淋巴細胞功能受損并與HCC預后不佳相關。

作為一類調節自身免疫反應的T淋巴細胞亞群，Treg在HCC腫瘤免疫過程中發揮重要作用。Huang等[10]的Meta分析證明在HCC患者中，高Treg浸潤組的1、3、5年生存率比低Treg浸潤組要差。首先，Treg作為免疫抑制和抗炎細胞，可以抑制各種細胞因子(如IL-6、IL-17)對T淋巴細胞的作用[11]。其次，Treg還能通過高表達相關免疫抑制分子(LAG-3、TIM-3等)抑制效應T淋巴細胞抗腫瘤功能[12]。當前研究表明，高Treg浸潤與HCC預后不良相關，Treg對肝癌預后調節的具體機制還有待進一步研究。

2 TIME中影響T淋巴細胞功能的關鍵免疫細胞及作用機制

樹突狀細胞(DC)作為抗原遞呈細胞，因能夠在攝取、加工和處理腫瘤抗原后特異性激活T淋巴細胞，普遍認為與HCC患者預后良好相關。然而，有研究表明CD14+CTLA-4+DC可以產生IL-10和吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO)，從而抑制CD4+T淋巴細胞免疫反應[13]，并誘導Treg在腫瘤區域的增殖分化進而促進HCC進展[14]。同時，Treg可誘導DC表達IDO，進而抑制T淋巴細胞反應并促進免疫耐受[15]。此外，有研究[16]證實CD4+、CD8+T淋巴細胞表面的抑制受體如程序性死亡受體-1(programmed cell death protein-1，PD-1)、TIM-3、CTLA-4在腫瘤組織中的表達高于非腫瘤組織和外周血，這些抑制受體能與DC抑制配體結合，誘導CD4+T淋巴細胞功能異常或抑制CD8+T淋巴細胞的細胞毒性反應(圖1)。因此，由于對效應T淋巴細胞的抑制功能增加，DC也被證明與HCC患者的不良結局相關。

巨噬細胞是肝組織中重要免疫細胞，在肝癌TIME中發揮作用的主要為M1(IFNγ、脂多糖誘導)和M2(IL-4、IL-13誘導)兩種亞型。一方面，Yu等[17]研究表明，TIME中 M1巨噬細胞能夠通過釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)，增加抗腫瘤因子IL-12、TNFα、IFNγ的產生；同時，極化的M1巨噬細胞下調免疫抑制因子IL-10和TGFβ的表達，促進CD8+T淋巴細胞和CD4+Th1細胞的招募和激活，促進抗腫瘤反應[17]。另一方面，由趨化因子CCL2/CCR2R軸誘導的M2巨噬細胞可通過分泌各種抑制因子和趨化因子如IL-6、巨噬細胞炎性蛋白-1(macrophage inflammatory protein 1，MIP-1)、巨噬細胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)抑制CD8+T淋巴細胞增殖進而促進腫瘤進展[18]。也有研究[19]表明，M2巨噬細胞可以通過上調miR-21-5p表達，激活YAP/β-catenin通路促進CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體(PD-1、TIM-3)表達和減少抗腫瘤因子(IFNγ、IL-2、TNFα)產生抑制抗腫瘤反應。同時，M2巨噬細胞也可分泌IL-10或在缺氧情況下通過ERK/NF-κB通路促進Treg在腫瘤部位積累[20]。Peranzoni等[21]研究表明巨噬細胞還可以形成相對靜態的細胞網絡以減少CD8+T淋巴細胞在腫瘤組織浸潤(圖1)。當前研究表明，肝癌TIME中浸潤的主要是促進腫瘤進展的M2巨噬細胞，該種巨噬細胞能夠通過影響T淋巴細胞功能來促進免疫耐受和癌細胞增殖、轉移來維持HCC的發生和發展。

髓樣抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)被稱為腫瘤調節的關鍵免疫細胞，在HCC腫瘤免疫過程中能夠表現出抑制T淋巴細胞功能和促進腫瘤發生的能力。首先，癌細胞能夠產生大量活性氧導致補體C3分泌，誘導MDSC通過P38/MAPK途徑產生IL-10抑制CD8+T淋巴細胞的增殖和激活[22]。其次，MDSC可以通過PD-1/PD-L1通路、精氨酸酶-Ⅰ(Arginase-1)的表達來抑制CD8+T淋巴細胞的功能或誘導T淋巴細胞凋亡[22-23]。除上述致瘤活性外，MDSC還能通過IL-10、TGFβ、TNFγ誘導腫瘤組織中Treg的分化從而促進腫瘤發生和發展[24](圖1)。上述研究表明，MDSC在HCC中起到促進腫瘤進展的作用，充分研究MDSC-T淋巴細胞免疫抑制軸或許能為HCC靶向治療提供創新途徑。

B淋巴細胞作為TIME細胞成分之一，在HCC進展中的作用仍有待進一步探究。有研究[25]指出腫瘤邊緣區域CD20+B淋巴細胞的增加與HCC的良好預后相關。根據Shi等[26]的研究，浸潤B淋巴細胞可以產生IFNγ和IL-12p40來刺激CD8+T淋巴細胞發揮腫瘤直接殺傷作用，同時促進Th1免疫反應而產生強大的抗腫瘤活性。Garnelo等[27]研究發現在B淋巴細胞耗盡時，CD8+T淋巴細胞上的PD-1表達上調，這表明CD8+T淋巴細胞的激活受到CD20+B淋巴細胞的調節。也有研究[28-29]表明，調節性B淋巴細胞(regulatory B cell，Breg)可通過分泌TGFβ和IL-10限制Th1和Th2的發育并促進Treg分化來負向調節免疫反應，并導致CD4+T淋巴細胞耗竭和CD8+T淋巴細胞免疫功能受損(圖1)。多數研究顯示，B淋巴細胞對于不同亞群T淋巴細胞的調節作用主要取決于HCC TIME的變化階段，因而還需進一步深入研究相關調節機制。

圖1 HCC免疫微環境中T淋巴細胞及其相關免疫細胞的調控作用及分子機制

3 TIME中影響T淋巴細胞功能的關鍵信號通路及調控機制

Wnt/β-catenin通常位于細胞連接處和細胞質中，該通路突變在HCC中頻繁發生。首先，趨化因子CCL5在β-catenin信號驅動中表達上調導致HCC TIME中DC和特異性CD8+T淋巴細胞水平顯著提高，而CCL5下調能夠引起該信號通路的免疫抑制[30]。Wnt/β-Catenin信號通路激活會擾亂CD8+T淋巴細胞的作用，誘導TIME中耗竭CD4+或CD8+T淋巴細胞數量增加，有助于建立腫瘤免疫抑制[31]。同時，β-catenin信號通路還可以通過上調T淋巴細胞表面抑制性受體PD-1的表達進而抑制CD8+T淋巴細胞毒性和浸潤水平[19]。Zhu等[32]研究表明，抑制Wnt/β-catenin途徑激活能夠促進HCC腫瘤組織招募更多的CD8+T淋巴細胞，顯著改善PD-1阻斷治療效果。總之，Wnt/β-catenin信號通路能夠在HCC進展中頻繁激活，并通過調節腫瘤相關T淋巴細胞功能來促進腫瘤進展。

TGFβ通路是一個由細胞膜到細胞核的經典信號傳導過程，在HCC中，TGFβ通路能通過T淋巴細胞來調節腫瘤的進展。首先，TGFβ能夠通過調節TBET、STAT4兩種轉錄因子的表達，抑制幼稚T淋巴細胞向Th1分化或通過激活SMAD依賴途徑來介導Treg的分化形成促進腫瘤進展[33]。其次，TGFβ能夠通過由Smad蛋白家族中Smad3、Smad4與輔助因子TOB1共同介導的路徑抑制CD4+T淋巴細胞增殖；或使T淋巴細胞線粒體中Smad蛋白磷酸化，通過調節能量代謝抑制T淋巴細胞增殖和免疫功能[34-35]。此外，TGFβ還能夠通過Smad3選擇性地增強PD-1基因轉錄，上調PD-1在CD8+T淋巴細胞上的表達，誘導CD8+T淋巴細胞耗竭促進HCC進展[36]。另一方面，TGFβ能夠通過腫瘤相關成纖維細胞(cancer associated fibroblasts，CAF)抑制Treg在腫瘤微環境浸潤[37]。TGFβ還能夠上調αE和β7亞單位在HCC腫瘤組織中的表達，促進記憶CD8+T淋巴細胞在腫瘤組織中駐留，增強腫瘤免疫功能。研究表明，TGFβ信號通路廣泛參與T淋巴細胞的功能調節，并在HCC中主要發揮促進腫瘤進展的作用。

另外，其他相關信號通路，包括JAK/STAT、VEGF等在HCC TIME中也發揮著重要作用。研究[38]表明，約60%的肝癌組織樣本中可以檢測到磷酸化的STAT3，且多與預后不良有關。一方面，HCC腫瘤細胞和CAF分泌的IL-6可以與DC上的IL-6R結合，啟動STAT3通路的下游磷酸化級聯反應，以抑制T淋巴細胞增殖并增加Treg的產生[39]。另一方面，IL-12可以通過STAT4信號通路增加抗凋亡基因的表達并能夠減少促凋亡基因在T淋巴細胞中的表達[40]。HCC腫瘤組織缺氧可以誘導VEGF產生，該通路不僅可以通過誘導免疫抑制受體(PD-1、TIM-3)的表達來介導CD8+T淋巴細胞耗竭，還可通過誘導Fas配體的表達降低CD8+T淋巴細胞毒性并引起細胞耗竭[41]。

TIME中與T淋巴細胞相關的信號通路在HCC發展過程中發揮著關鍵調控作用，所涉及機制仍然有待進一步研究。

4 基于T淋巴細胞的免疫療法在HCC中的應用

免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICI)作為新型的腫瘤治療模式，能夠顯著改善腫瘤患者的臨床預后。目前正在廣泛研究的HCC相關免疫檢查點有PD-1、CTLA-4、LAG3和TIM-3等。一項納入262例患者的研究[42]評估了尼伏倫布(PD-1單抗)在晚期HCC患者中的效果，結果顯示尼伏倫布具有良好的安全性和有效性[客觀緩解率(objective response rate，ORR)=20%]。Agdashian等[43]研究發現，CTLA-4阻斷劑tremelimumab可以引起腫瘤特異性T淋巴細胞的激活以及促進CD8+T淋巴細胞腫瘤浸潤。盡管當前單一ICI療法在HCC治療中取得一定的成果，但其有效率(10%～20%)仍不能令人滿意[44]。因此，有研究[45]將CTLA-4抑制劑與PD-1抑制劑相結合用于治療HCC患者，數據表明ICI聯合治療有可能在免疫治療中實現協同效應，增強抗腫瘤反應。

過繼細胞轉移療法(adoptive cell transfer-based therapies，ACT)由于能夠提供持續抗腫瘤能力，在HCC免疫療法的研究中引起高度關注。目前基于ACT的HCC治療主要包括細胞因子誘導的殺傷細胞療法(cytokine-induced killer，CIK)和嵌合抗原受體修飾T細胞療法[46]。在一項評估由IL-2和CD3抗體孵育的CIK細胞作為HCC輔助治療有效性的試驗[47]中，CIK細胞治療能夠延長患者無復發生存時間，免疫治療組相比對照組為44.0 vs 30.0個月。Szoor等[48]發現，在小鼠肝癌異種移植模型中，GPC3-CAR-T淋巴細胞能夠有效地抑制高度表達GPC3+的腫瘤細胞生長，顯示出強大的抗腫瘤活性。以下為已注冊的采用CAR-T療法對HCC患者進行臨床實驗的項目編號：NCT02723942、NCT02395250、NCT03084380、NCT02541370、NCT03899415(ClinicalTrials.gov)。

腫瘤疫苗是利用腫瘤自身相關抗原，如AFP、GPC3、人端粒酶反轉錄酶等刺激免疫系統，促進幼稚T淋巴細胞增殖和抗原特異性T淋巴細胞產生，進而有效誘導機體對HCC產生特異性免疫反應。Li等[49]使用腺相關病毒載體將AFP轉移到DC細胞中刺激產生DC衍生外泌體，這些外泌體不僅能夠促進幼稚T淋巴細胞增殖和抗原特異性T淋巴細胞產生，還可以有效誘導機體對HCC的特異性免疫反應。一項以評價GPC3衍生的多肽疫苗療效的二期試驗[50]顯示，對比只接受手術的患者，同時接受疫苗接種和手術的HCC患者術后1年復發率下降15%，5年和8年生存率分別提高了10%和30%。

值得注意的是，盡管基于T淋巴細胞的腫瘤免疫療法提高了HCC治療的反應率，但仍有多數患者未能從這種有前景的治療中受益。因此，迫切需要發現新的HCC免疫治療靶點，以提高腫瘤免疫治療效果。

5 總結與展望

綜上所述，在多種信號通路及B淋巴細胞、DC等細胞調節下，T淋巴細胞作為TIME中主要成分，對于HCC免疫耐受的形成有重要作用。隨著對TIME在HCC發生機制及治療作用中的研究不斷深入，理解與腫瘤免疫相關的T淋巴細胞亞群及其分子機制將有利于開發出新的治療策略，提高HCC患者免疫治療的有效性和安全性。但目前關于HCC TIME的研究尚未完全明晰：首先，多數已報道的數據主要聚焦于HCC外周血中T淋巴細胞亞型及相關功能，而TIME中T淋巴細胞功能由腫瘤細胞、免疫細胞、細胞外基質和細胞因子等多種因素共同影響，因此尚缺乏對肝癌組織原位免疫細胞相互作用的機制研究。其次，肝臟是一個相對免疫豁免的器官，T淋巴細胞介導的免疫反應是腫瘤監測和清除的核心，如何增強T淋巴細胞對肝癌細胞的特異性免疫反應仍然有待進一步研究。最后，由于現有免疫療法對于癌細胞殺傷的局限性和單一性，以致HCC仍存在復發和進化的可能，目前基于T淋巴細胞的免疫療法所獲得的臨床療效仍十分有限。因此，更加深入地了解肝癌TIME，增進對不同亞群T淋巴細胞功能的認識，將對于闡明HCC免疫調控機制和研發更有效的治療手段具有重要意義。

利益沖突說明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：韓孟奎負責文獻資料收集分析，論文撰寫；李晉負責論文修改，對文章的知識性內容做出批評性審閱；楊小華負責指導撰寫論文并最后定稿。