中醫藥調控上皮-間質轉化抑制肝癌轉移的研究進展

王 玨，張春蕾，湯凱悅，鄭培永，宋海燕

上海中醫藥大學附屬龍華醫院 a.脾胃病研究所，b.急診科，上海 200032

肝癌是全球第六大常見惡性腫瘤，全球癌癥死亡率排名第三，肝細胞癌(HCC)占75%～85%[1]。轉移和復發是影響HCC死亡率的主要因素[2]。流行病學數據顯示，HCC最常見轉移部位為肝，其次是肺、淋巴結、骨等肝外組織[3]。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在肝癌侵襲、轉移過程中發揮關鍵作用[4-5]。EMT是指上皮表型細胞通過特定程序失去連接和極性轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，賦予了細胞轉移、抗凋亡及免疫逃逸能力，在發育、組織創傷愈合、器官纖維化中起關鍵作用，并參與癌癥進程[6]。Pinzani等[4]提出“逃逸反應”假說來解釋腫瘤細胞發生EMT轉化：腫瘤細胞對瘤組織缺氧、壞死、炎癥和氧自由基增加等不利微環境作出適應性反應，轉化為間質表型趨向更適宜環境移動以逃避損傷凋亡。在肝癌侵襲轉移時，HCC細胞發生EMT有助于傳播擴散。HCC患者無腫瘤復發的生存期與EMT水平負相關，而阻滯EMT可顯著抑制HCC細胞的遷移[7]。基于EMT關鍵分子的預后診斷方法及靶向EMT的治療策略也成為肝癌轉移復發的研究熱點。

目前手術、放化療、靶向和免疫治療在肝癌治療中發揮重要作用，但伴隨的術后轉移復發、耐藥、副作用等成為治療的重大障礙[8]。在我國肝癌綜合治療方案里，中醫藥被長期運用于肝癌的治療，尤其是對于中晚期患者；而近年來中藥來源的多種活性化合物在肝癌治療研究中的效應也引起廣泛關注[9]。《金匱要略·瘧病脈證并治》首次提到徵瘕，以堅硬不移，痛有定處者為徵；聚散無常，推之游移不定，痛無定處者為瘕。據其癥狀，現代醫家將肝癌歸為“徵”和“瘕”的范疇。中醫藥基于肝癌“本虛標實”的病機進行系統性的多層面治療[10]。近年來研究表明，抑制或逆轉HCC細胞EMT是中藥發揮治療肝癌侵襲轉移作用的重要途徑之一。本文介紹EMT相關機制，并對近年來中藥及其來源化合物通過調控EMT抑制肝癌侵襲轉移的研究進行概述，以期促進發展基于中醫藥來源的肝癌轉移復發防治新策略。

1 HCC轉移相關細胞EMT調控機制

EMT受到包括SNAIL(Snail、Slug)、BHLH(Twist1、Twist2、E12、E47)、ZEB(ZEB1、ZEB2)等在內的EMT轉錄因子(EMT-inducing transcriptions factors，EMT-TF)的調控，使上皮型細胞丟失E-鈣黏蛋白、Occludin等細胞間連接相關分子，獲得波形蛋白(Vimentin)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)等骨架和極性相關蛋白以及基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)等間質型標志物，導致細胞間黏附下降、形態改變、遷移和侵襲能力增強[11]。其中SNAIL是肝癌EMT最主要的誘導者，在高轉移的肝癌細胞中高表達，誘導EMT促進肝癌細胞轉移[12]。

肝癌細胞EMT-TF表達或活化受多種分子調控，如TGFβ、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、Smad蛋白、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)、整合素等，通過多種信號通路進行調控[13-18]。

EMT調控信號通路包括TGFβ、Wnt/β-catenin、生長因子(GF)/受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTK)、Hedgehog、Notch、Hippo、低氧等信號通路[18](圖1)。TGFβ通路是目前已知介導EMT轉化最重要的途徑，包括經典途徑(Smad依賴通路)和非經典途徑(Smad非依賴通路)。Wnt/β-catenin信號通路是EMT調控的另一重要通路，β-catenin入核與TCF/LEF形成復合物，可直接抑制E-鈣黏蛋白轉錄，促進轉錄因子Snail、Slug、Twist的轉錄表達。腫瘤微環境中的多種生長因子可結合并激活其相應RTK，繼而激活包括由PI3K、Ras、Src和ILK等介導的多種信號通路，激活通路下游EMT轉錄因子。其他通路也基本通過促進或活化EMT-TF發揮作用。這些信號通路間又存在多個環節的交互調控，如RTK激活的通路也是許多TGFβ誘導的非Smad信號通路，而RTK可通過自分泌信號正反饋回路增強TGFβ1的表達，在EMT轉化及肝癌轉移過程中共同發揮重要作用[19]。

注：A，Wnt/β-catenin信號通路；B, TGFβ/SMAD信號通路；C, GF/RTK信號通路; D, Jagged/Notch信號通路; E, Hedgehog信號通路;F, Hippo信號通路；G, 低氧信號通路。

除基因表達水平外，EMT-TF的轉錄后水平和功能調控對于EMT也很重要。非編碼RNA，尤其是microRNA(miRNA)，可直接影響Snail、ZEB1等EMT因子蛋白翻譯，此外也可阻斷其他信號通路，發揮逆轉EMT抑制腫瘤的作用[20]，其中EMT相關研究中最多的兩類miRNA是miR-34和miR-200家族。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在EMT的調節中也發揮重要作用，其中多數參與TGFβ信號調節[21]。

2 中藥或其組分靶向EMT抑制HCC轉移的作用和機制

近年來肝癌的中醫藥干預和個體化治療體現了其獨特優勢，中藥復方或由中藥來源的天然化學物質被認為是HCC的重要補充和替代治療。其中部分藥物機制與EMT調控相關，下面將簡介靶向EMT抑制HCC轉移的中藥或其組分。

2.1 中藥復方 臨床研究[22]顯示，鱉甲煎丸具有縮小肝癌原位瘤生長，抑制復發的作用。鐘曉丹等[23]發現鱉甲煎丸含藥血清可抑制肝癌細胞HepG2侵襲遷移能力，進一步研究揭示其可抑制NF-κB活化入核阻止Snail的表達，使E-鈣黏蛋白表達增加，從而抑制TGFβ誘導的EMT。此外，鱉甲煎丸還能通過抑制GSK-3β的磷酸化促進β-catenin的降解以阻斷Wnt/β-catenin信號通路從而逆轉EMT[24]。鐘崇等[25]通過體外實驗發現，健脾化瘀方含藥血清可呈劑量依賴性下調肝癌細胞MHCC97H中Smad磷酸化，后者可促進Snail轉錄進而誘導EMT。馮坤良等[26]發現，健脾化瘀方還可通過調控外泌體從而上調肝癌細胞E-鈣黏蛋白表達，抑制N-cadherin和Vimentin表達，降低肝癌細胞侵襲、遷移能力。扶正抗癌方可改善移植性肝癌大鼠生存狀態，抑制腫瘤生長轉移[27]。方瑜等[28]發現扶正抗癌方含藥血清可逆轉TGFβ1誘導的HepG2細胞EMT，抑制MMP表達，從而抑制肝癌侵襲轉移。梁雪婧等[29]報道軟堅護肝片在臨床使用中具有預防肝癌復發的作用。肝癌患者術后服用軟堅護肝片及甘草甜素片干預較服用葫蘆素片及肌苷的對照組患者3年和5年的肝癌復發率均顯著下降。孫振等[30]等通過后續實驗發現軟堅護肝片含藥血清能顯著逆轉TGFβ1誘導的肝癌細胞Huh7發生EMT，從而抑制細胞遷移能力。

中藥復方松友飲聯合經肝動脈化療栓塞術在臨床治療中可減輕肝癌肺轉移率[31]，對其抑制轉移復發的效應機制研究較多。動物實驗發現，該復方可有效抑制化療后殘余肝癌組織的EMT[32-33]，降低殘余肝癌組織侵襲轉移潛能，并減少殘余肝癌再接種的復發及延長裸鼠生存時間。其機制研究表明，松友飲能通過抑制β-catenin通路阻止殘余癌組織EMT。此外，松友飲可下調MHCC97H細胞TGFβ表達水平，抑制Smad磷酸化及與Smad4組裝成異源三聚體，阻斷其入核與相應EMT轉錄因子結合。中藥復方肝積方可抑制肝癌轉移復發，提高患者生存率[34]。本課題組近期研究發現，肝積方含藥血清可抑制肝癌細胞Akt通路活化及snail、vimentin分子表達，上調其E-鈣黏蛋白、N-cadherin表達水平，體內實驗同樣也顯示肝積方對大鼠原位肝癌組織上述EMT相關分子的調控作用，提示肝積方可能通過調控Akt信號通路抑制EMT發揮抑瘤作用。

2.2 單味中藥或組分 中藥提取物或化合物多年來被認作是藥物制備的結構基礎，在現代醫學腫瘤的新型治療研究中具有重要地位。近年來，一些具有抑瘤作用的單味中藥材或其成分通過體內外實驗顯示具有逆轉EMT作用，其中部分藥物與肝癌轉移調控機制相關。

程清波等[35]通過侵襲遷移實驗發現山慈菇含藥血清可顯著抑制肝癌細胞HepG2侵襲，其作用與調控EMT轉化相關。Yan等[36]通過體內實驗發現，全蝎含藥血清可以抑制Hepa1-6肝癌細胞的侵襲遷移能力，全蝎水提物能抑制裸鼠模型中肝癌的生長及轉移。進一步研究揭示全蝎可逆轉肝癌細胞EMT，提高E-鈣黏蛋白的表達，降低N-cadherin和Snail的表達。Wang 等[37]發現復方苦參注射液干預SMMC7721肝癌細胞，可抑制β-catenin活化導致的c-Myc表達增加，進而調控EMT，減輕細胞侵襲和遷移能力。通過細胞劃痕、Transwell實驗，付江等[38]發現銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract, GBE)含藥血清中血小板活化因子(PAF)水平降低。用GBE含藥血清處理的MHCC97H和Hep3B細胞的增殖、侵襲和遷移能力顯著下調，細胞E-鈣黏蛋白升高，而Vimentin、Snail表達降低，提示GBE含藥血清可能通過下調PAF逆轉肝癌細胞EMT。

姜黃的主要成分姜黃素具有抑瘤作用，可通過逆轉IL-6/STAT3介導的EMT來抑制HCC的進展[39]。不僅如此，姜黃素還能通過降低UNC119(lipid-binding chaperone protein uncoordinated 119)的表達抑制Wnt/β-catenin和TGFβ/EMT信號通路，從而抑制肝癌細胞生長和遷移[40]。黃連素是一種生物堿，最近實驗[41]發現，黃連素可通過結合TGFβ R受體抑制TGFβ/Smad通路，呈劑量依賴性地抑制肝癌細胞的侵襲和遷移。張彥兵等[42]研究發現，白花蛇舌草總黃酮FOD可逆轉TGFβ1誘導MHCC97H肝癌細胞EMT改變，下調細胞侵襲能力。呂美嫻等[43]發現裂果薯皂苷單體Ⅰ可以阻斷SMMC7721肝癌細胞中TGFβ1/Smad信號通路，抑制EMT發揮拮抗肝癌細胞侵襲轉移的作用。劉敏等[44]發現丹參酮ⅡA干預MHCC97H肝癌細胞48 h，使p-Smad3、Snail和N-cadherin、Vimentin降低，Smad7、E-鈣黏蛋白和Ep CAM明顯升高，抑制肝癌細胞EMT及遷移能力。Qin等[45]發現黃芪甲苷Ⅳ可抑制肝癌細胞Huh7 和MHCC97H侵襲遷移，且觀察到黃芪甲苷Ⅳ干預的肝癌細胞形態由梭形變為橢圓形，逆轉轉錄因子Slug的上調及EMT相關標記分子的變化，這與其下調細胞Akt和GSK-3β的磷酸化進而抑制β-catenin有關。蛇床子素具有多種藥理作用。Lin等[46]發現，蛇床子素可提高E-鈣黏蛋白表達，降低N-cadherin、Vimentin水平及MMP2和MMP9的表達，抑制肝癌細胞遷移能力。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚有機化合物，近幾年研究發現它對多種腫瘤具有抑制作用。研究[47]發現它可以通過上調miR-186-5p，降低Twist1表達，從而抑制肝癌細胞發生EMT，抑制細胞的侵襲遷移。Xing等[48]發現，從鐵皮石斛中提取的異紫羅蘭素(isoviolanthin)可顯著降低TGFβ1處理的肝癌細胞HepG2、BEL-7402的遷移和侵襲能力。進一步研究發現，異紫羅蘭素可通過失活TGFβ/Smad和PI3K/Akt/mTOR信號通路，下調Snail、Slug表達，逆轉TGFβ1介導的細胞EMT。蘿卜硫素是一種富含于十字花科植物的天然化合物，在多種癌癥中顯示有效抗腫瘤作用。在TGFβ誘導的肝癌細胞中，蘿卜硫素干預抑制了細胞侵襲轉移及阻止細胞向成纖維細胞形態的改變，逆轉細胞的EMT過程[49]。

綜上，中藥或其來源的化合物均可通過逆轉EMT抑制肝癌細胞遷移能力，其調控機制多與TGFβ/Smad或Wnt/β-catenin信號通路有關(表1、2)，但復方或單味藥物研究中多缺少具體的信號途徑探索。

表1 中藥復方調控EMT抑制HCC轉移

表2 單味中藥/組分調控EMT抑制HCC轉移

3 小結與展望

受纖維化、炎性浸潤、缺氧等腫瘤微環境影響，包括采用靶向治療、放療和手術等標準治療方法干預導致的微環境變化，多個分子、多種信號通路被激活從而啟動或加速腫瘤細胞中EMT轉化，在腫瘤轉移和侵襲中發揮重要作用，因此調控EMT已成為抑制腫瘤進展的重要途徑[50]。目前一些靶向EMT的分子已經或正在進行臨床/臨床前試驗，其藥效機制主要包括阻斷EMT上游信號通路、應用合成miRNA(如miR-34、miR-200)在轉錄后水平上干擾EMT-TF。如TGFβRⅠ抑制劑LY-2157299、ALK1小分子抑制劑PF-03446962等正在進行臨床試驗[50]。但需要注意的是，EMT和間質-上皮轉化(MET)之間是動態轉換過程，而促進MET可能促進循環腫瘤細胞的定植和轉移，導致相反的治療效果；另外EMT也是參與創傷愈合、組織修復等生理過程中的重要角色，全身性干預可能影響正常生理功能[11]。因此，腫瘤微環境多樣性及多種調控通路相互串擾性是更深入了解EMT調控以開發新治療方法的主要挑戰，在針對EMT調控的防治肝癌轉移復發藥物研究中，需要綜合考慮腫瘤細胞異質性、腫瘤微環境進行單個或聯合多個信號途徑阻斷來實現抑制腫瘤進展的效應。

中藥或中藥聯合常規手術和放化療是治療肝癌的有效途徑[51-52]。研究顯示中醫藥及其來源化合物在防治肝癌轉移復發中發揮重要作用，但其相關機制方面研究仍然較少。隨著研究人員對EMT在腫瘤進展中的作用和機制的揭示，近年來越來越多的研究發現，一些中藥或其組分可調控腫瘤細胞EMT，可能是其發揮抑制肝癌轉移復發作用的重要途徑。但由于中藥的組成成分及藥物入血組分的復雜性，對復方或單藥進行EMT機制研究多采用含藥血清干預肝癌細胞，存在異種血清干擾、實驗不穩定性。而單獨體內實驗不能充分證明中藥干預細胞EMT的具體環節，可能對腫瘤微環境、多種信號通路、多個轉錄因子都具有調控作用，且對信號通路的探討也有局限性。因此，目前的機制研究多停留在中藥對細胞EMT標志物表達水平改變的初步研究上，其中的靶分子或信號通路有待更深入更嚴謹的實驗探討。開展體內原位腫瘤藥物干預實驗輔以體外細胞實驗能夠更有力地證明中藥的作用機制，有利于推動中醫藥單獨或聯合以更有效地控制包括肝癌在內的腫瘤轉移治療方法的臨床應用。此外探討中藥有效成分對EMT的調控機制，也有利于促進防治肝癌轉移復發的新型天然藥物的研發。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：王玨負責資料分析及撰寫論文；張春蕾和湯凱悅負責收集數據；鄭培永、宋海燕負責擬定寫作思路，修改論文并最后定稿。