基于網絡藥理學對紫蘇-百合藥對治療原發性失眠的作用機制研究

王振亦 常 澤 胡文悅 林景峰 王育純 馬華萍 劉甘露 韓振蘊

(1 北京中醫藥大學東方醫院，北京，100078；2 北京中醫藥大學深圳醫院(龍崗)，深圳，518172)

失眠是指盡管有合適的睡眠機會和睡眠環境，卻依然對睡眠時間和(或)質量感到不滿足，并且影響日間社會功能的一種主觀體驗，是最常見的睡眠問題之一[1]。失眠分為原發性失眠和繼發性失眠，其中原發性失眠是指不是因其他疾病、精神障礙和藥物/物質濫用所引起的失眠[2]。

中醫古籍中多稱失眠為“不寐”“目不瞑”“不得眠”等，現代中醫學與現代醫學稱謂相同[3]。紫蘇-百合是中醫治療失眠的對藥，國醫大師王琦治療失眠的常用方“高枕無憂湯”就有此藥對[4]。兩藥相合為用最早見于《侶山堂類辨》，其載“余植百合，其花朝開暮合，紫蘇之葉，朝挺暮垂，俱能引陽氣而歸陰分”[5]，但書中并不用本方治療失眠。后陳修園在其著作《醫學實在易》中，以上述理論為基礎，用百合、紫蘇、龍骨、牡蠣、茯神、棗仁等治療“陽不歸陰”的失眠[6]。后近代名醫范文甫以此二藥治療黃振聲“苦不寐，百藥不能治”，最后“三貼而安”[7]。

中藥網絡藥理學研究旨在從系統層次和分子水平揭示中藥方劑的奧秘,促進中藥研究從當前的“單一靶標，單一藥物”模式轉向“網絡靶標，多成分藥物”的新模式[8]。李梢教授在1999年提出了中醫藥與分子網絡之間的可能關系[9]，這一猜想的提出成為了中藥網絡藥理學的開端。在此之后，李梢教授搭建了中藥網絡藥理學的研究框架，并進行了對寒/熱中藥配伍和寒/熱證候的研究[10-11]。在2013年，李梢教授首次運用其建立的網絡藥理學研究平臺，進行了清絡飲(苦參、青風藤、黃柏、萆薢)與類風濕性關節炎的研究，這一研究不僅預測了清絡飲的活性成分和協同成分，而且還解釋了該配方的組合規則。并且得到了文獻證據的證實，證明了網絡藥理學研究的可行性[12]。《世界中醫藥》雜志于2021年發布了《網絡藥理學評價方法指南》，為網絡藥理學研究的規范發展提供了基礎[13]。

本研究基于網絡藥理學策略，通過目前已有的在線數據庫，挖掘并整理紫蘇-百合藥對的入血成分及相關作用靶點，并與疾病數據庫中的原發性失眠靶點相匹配，篩選共有靶點。然后通過基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析，篩選得到紫蘇-百合藥對治療原發性失眠的相關通路，旨在揭示其分子作用機制并為其進一步研究與臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據資料 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://www.tcmspw.com/tcmsp.php)，中藥綜合數據庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid)，Uniprot蛋白質序列數據庫(https://www.uniprot.org/)，GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)，在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)，STRING數據庫(https://string-db.org/)，Cytoscape 3.7.2軟件，R4.0.2軟件，Perl語言。

1.2 研究方法

1.2.1 紫蘇-百合藥對的活性成分的篩選及作用靶點的預測 使用TCMSP分別檢索紫蘇、百合，以得到紫蘇-百合藥對的化學成分及作用靶點。以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18作為活性化合物的篩選條件。通過TCSMP平臺查詢所得活性成分的靶點信息，運用Perl語言及uniprot數據庫得到紫蘇-百合藥對作用的基因靶點。

1.2.2 收集原發性失眠的靶點并預測共同作用靶點 本研究以GeneCards、OMIM數據庫為平臺。以“Primary Insomnia(原發性失眠)”為檢索詞條，對原發性失眠相關基因進行檢索和收集，并去除重復項，共得到2 405個相關疾病靶點。然后使用R語言將原發性失眠相關基因靶點與之前所得的紫蘇-百合藥對作用相關靶點進行比較，篩選出共同靶點，繪制韋恩圖。

1.2.3 網絡模型的構建及分析 使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制紫蘇-百合藥對與原發性失眠的“成分-靶點-基因-疾病”相互作用網絡圖。然后將共同作用靶點輸入到STRING數據庫中進行檢索，將蛋白種屬設置為“Homo Sapiens”，獲得蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡圖，并用Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化。

1.2.4 通路富集分析 利用David網站中的Functional Annotation Tool功能，對藥物-疾病共同作用基因靶點進行GO功能與KEGG信號通路富集分析，并將結果以條形圖和氣泡圖的形式輸出。

2 結果

2.1 紫蘇-百合藥對的活性成分的篩選及作用靶點的預測 通過在TCMSP、TCMIP數據庫中檢索紫蘇的全部化學成分共116個、百合的全部化學成分共21個。紫蘇的主要有效成分為紫蘇醛[(S)-p-Mentha-1，8-dien-7-al]，雖然未滿足篩選條件，仍納入到有效成分中，共得到紫蘇有效活性成分16個；得到百合的有效化學成分共7個，其中Beta-sitosterol(已在表1中標黃)為二者共有，故總共得到紫蘇-百合藥對22個有效化學成分，化合物詳細信息見表1。在TCSMP數據庫查詢上述22個有效化合物的作用靶點，除去Supraene無相應靶點，并刪除重復靶點，共得到120個藥物作用靶點。用Uniprot數據庫和perl語言對120個藥物作用靶點尋找靶基因，共得到97個藥物作用靶基因。

表1 紫蘇-百合藥對活性成分基本信息

2.2 篩選紫蘇-百合藥對活性成分與原發性失眠共同作用靶點 在GeneCards、OMIM數據庫中，以“Primary Insomnia”為檢索詞條，對原發性失眠相關基因進行檢索和收集，并去除重復項，共得到2 402個相關疾病靶點。然后將這2 402個靶點與97個紫蘇-百合藥對活性成分靶點運用R語言繪制韋恩圖，圖中綠色圓形代表原發性失眠相關基因，橙色圓形代表紫蘇-百合藥對活性成分靶點，圖中交集即為藥物-疾病共同靶點53個即紫蘇-百合藥對治療原發性失眠的重要靶點。見圖1。

圖1 紫蘇-百合治療原發性失眠共同靶點的韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡構建與分析 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖中粉紅色正方形節點代表“原發性失眠”，綠色菱形節點分別代表“紫蘇”和“百合”；紫色六邊形圓形節點代表作用靶點，淡藍色圓形節點代表藥物活性成分，二者之間的連線代表相互作用關系。使用Cytoscape軟件對圖2進行分析后，得到度值排名前五的活性成分為木犀草素(Luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、β-胡蘿卜素(Beta-carotene)、3-去甲基秋水仙堿(3-Demethylcolchicine)。見圖2。

圖2 紫蘇-百合藥對“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖

2.4 PPI網絡構建 在STRING數據平臺輸入所得藥物—疾病共同靶點，分析得到PPI網絡圖，共包含53個節點，477條邊，平均度值為18，用Cytoscape 3.7.2軟件，按度值從大到小，由內向外排列可視化后可得到圖3。其中度值越大圖中圓形面積越大、顏色越深，度值越小，圓形面積越小、顏色越淺，每條邊代表PPI關系，線條越多代表關聯度越大，PPI圖中的靶點排序如圖4。

圖3 PPI網絡

圖4 PPI圖中靶點排序

2.5 關鍵靶點GO生物功能注釋 將上述53個藥物—疾病共同靶點經過David網站GO富集分析選取生物學過程(Biological Process)、細胞組分(Cellular Component)及分子功能夠(Molecular Function)3部分。結果顯示，交集基因集合共富集至284條生物學過程通路中；富集至35條細胞組分通路中；富集至58條分子功能通路中，按照富集基因數由多到少排序，按基因富集數目由多到少排序，前10個GO功能富集柱狀圖和氣泡圖見圖5，柱狀圖中縱坐標表示基因富集數量，氣泡圖中縱坐標表示通路名稱。由柱狀圖可以看出，生物學過程通路主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控(Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase Ⅱ Promoter)、藥物應答(Response to Drug)、凋亡過程的負調控(Negative Regulation of Apoptotic Process)等通路；細胞組分通路主要涉及細胞質膜(Plasma Membrane)、膜的組成部分(Integral Component of Membrane)、細胞質(Cytoplasm)等通路；分子功能通路主要涉及蛋白結合(Protein Binding)、相同蛋白結合(Identical Protein Binding)、酶結合(Enzyme Binding)等通路。表明紫蘇-百合藥對可能通過多個GO生物功能發揮治療作用。

圖5 GO富集分析中BP、CC、MF通路的柱狀圖和氣泡圖

2.6 KEGG信號通路富集分析 將53個藥物-疾病共同靶點經David網站運行，共得到102條KEGG信號通路，按照富集基因數由多到少排序，前25個GO功能富集柱狀圖見具體信號通路圖見圖6。P代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。主要涉及HIF-1信號通路(HIF-1 Signaling Pathway)腫瘤壞死因子信號通路(TNF Signaling Pathway)，5-羥色胺突觸(Serotonergic Synapse)，PI3K-AKT信號通路(PI3K-AKT Signaling Pathway)等。

圖6 KEGG信號通路富集分析

3 討論

失眠對個人和社會均有很大的危害，失眠不僅會導致患者罹患內科疾病的發生率顯著高于非失眠人群，也會導致精神障礙的發病率增高。失眠除了會導致精神和身體的疾病，對公共衛生也會造成影響，如社會經濟損害、醫療設施使用增加、工作表現下降，甚至死亡率增加[14]。

由“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖可知，紫蘇-百合藥對主要的活性成分是木犀草素。木犀草素是一種常見的膳食類黃酮，廣泛存在于中草藥中。Kim等[15]在一項小鼠實驗中發現，口服木犀草素可以降低睡眠潛伏期，增加總睡眠時間，并通過腦電圖和肌電圖發現了木犀草素增加了非快速眼動睡眠時間，減少了清醒時間。而且現已有研究證實木犀草素可以抑制多種炎癥介質[16]，而失眠與炎癥介質的產生有著一定的相關性[17]，推測木犀草素是通過抑制炎癥介質的產生來調控睡眠。在對豆甾醇的研究中發現，小鼠在經過20 d的豆甾醇給藥后，會導致肝臟脂質中氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽活性增高[18]。而已有研究發現非器質性失眠的患者血清中氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽含量均降低[19]，我們可以推測豆甾醇可能會通過提高氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽活性來治療失眠。

由PPI網絡圖可知，紫蘇-百合治療原發性失眠的關鍵基因靶點是蛋白激酶B1、白蛋白、白細胞介素6、血管內皮生長因子A、腫瘤壞死因子等。蛋白激酶B是PI3K/AKT信號通路的一部分，此通路也是本研究發現的紫蘇-百合治療原發性失眠的可能通路之一。目前已有研究表明，該信號通路與失眠存在相關性[20-21]。在動物實驗中發現，慢性睡眠剝奪可以導致小鼠海馬組織中磷酸化蛋白激酶B表達下降，從而抑制下游部分蛋白的表達，進而影響周圍炎性環境，促進炎癥介質腫瘤壞死因子-α的釋放[22]。通過比較原發性失眠患者與健康患者血清中腫瘤壞死因子-α的表達水平發現，原發性失眠患者血清中腫瘤壞死因子-α的含量明顯高于健康對照組，證明了腫瘤壞死因子-α的表達水平與原發性失眠有密切的相關性[23]。Irwin等[24]在一項研究成人睡眠障礙、睡眠持續時間和炎癥的Meta分析中發現，白細胞介素-6與睡眠障礙有相關性，同時Nowakowski等[25]在一項對295名圍絕經期婦女的調查中發現較低的睡眠效率與較高的白細胞介素-6水平有關。

KEGG富集分析表示，紫蘇-百合藥對可能從多個通路對原發性失眠發揮治療作用。失眠患者體內腫瘤壞死因子-α含量增高，而增多的腫瘤壞死因子-α可以通過腫瘤壞死因子信號通路激活核因子κB的釋放[26]，而王志偉等在臨床研究中發現原發性失眠患者血清中核因子κB水平升高[27]。我們可以推測紫蘇-百合藥對可以減少患者體內腫瘤壞死因子-α的含量從而減少核因子κB的釋放，以改善失眠。

5-羥色胺突觸通路具有動態調節的體內5-羥色胺受體水平作用，當升高5-羥色胺水平后，會導致5-羥色胺2A[28]、5-羥色胺2C[29]的功能下調，Landolt等[30]通過回顧性研究發現5-羥色胺2A、5-羥色胺2C受體拮抗劑可以延長慢波睡眠和深慢波睡眠時間，有臨床試驗發現在對失眠患者進行有效治療后，血清5-羥色胺水平也會明顯升高[31]。

綜上所述，紫蘇-百合藥對治療原發性失眠具有多成分、多靶點、多通路的作用機制特點，為紫蘇-百合藥對治療原發性失眠提供了實驗研究的方向。