基于網絡藥理學和分子對接探討肉蓯蓉苯乙醇總苷對肝細胞癌的潛在分子機制

張嘉偉 文麗梅 胡君萍 楊建華

(1 新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊，830054；2 新疆醫科大學第一附屬醫院藥學部，烏魯木齊，830011)

原發性肝癌是全球高發病率和致死率的惡性腫瘤之一，5年內的生存率僅為7%[1]。肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是其中最主要的病理類型，占85%以上[2]。最新數據表明，我國HCC的病死率和發病率分別排在所有惡性腫瘤的第3位和第4位，具有發展較快、易復發的特點[3-4]。肝癌的病因和發病機制尚不清楚，其發生可能與宿主基因多態性、環境因素(包括代謝綜合征和黃曲霉毒素B1)、飲酒和病毒因素(包括乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染)的相互作用有關[5]。中藥可用于晚期HCC患者，具有抗腫瘤、減少放療化療的不良反應、提高腫瘤患者免疫力、改善生命質量等作用[6]。

肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma或管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk)Wight的干燥帶鱗葉的肉質莖[7]，具有補腎、益精、潤燥、通便的功效，是我國西北干旱地區特有的名貴補益類藥材，應用歷史悠久。肉蓯蓉始載于東漢《神農本草經》：“味甘、微溫。主五勞七傷，補中，除莖中寒熱痛，養五臟，強陰，益精氣，多子，婦人癥瘕，久服輕身”，被列為上品[8]。肉蓯蓉苯乙醇總苷(Phenylethanoid Glycosides from Cistanche，CPhGs)作為肉蓯蓉中的主要有效成分，包括毛蕊花糖苷、松果菊苷、紅景天苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷、管花苷B等[9]，具有肝臟保護、抗癡呆、抗疲勞、缺血保護、抗骨質疏松、潤腸通便、免疫調節、抗衰老及改善生殖等作用[10]。已有研究證明，CPhGs具有良好的防治肝癌作用。Yuan等[11]的研究表明CPhGs通過外源性和內源性凋亡途徑抑制H22細胞的生長。胡瓊等[12]發現CPhGs能夠抑制肝癌細胞的生長，這可能與CPhGs降低荷瘤小鼠血清中AFP的含量，提高荷瘤小鼠的免疫力有關。目前，尚未發現針對CPhGs防治HCC作用及其分子作用機制的深入研究，其活性成分、作用靶點及分子機制尚未完全闡明。

網絡藥理學將現有的“一靶一藥”方式更新為“網絡靶點-多成分”的研究方式，即在此基礎上對中藥的療效進行綜合分析，從系統視角和分子水平探索中醫藥，構建中醫藥網絡藥理學新思路[13-14]。本研究通過網絡藥理學策略，基于中醫藥整體觀，對CPhGs防治HCC的作用機制進行系統探討，結合“中藥-活性成分-靶點-信號通路”的多層次網絡模式，預測CPhGs防治HCC作用的關鍵靶點及作用機制，并利用分子對接技術進行驗證，闡述CPhGs多成分、多靶點、多通路的協同作用機制，為顯著提升CPhGs的藥用資源開發領域，為后續研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 CPhGs類成分的收集 通過檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)、中醫藥百科全書數據庫(Encyclopaedia of Traditional Chinese Medicine,ETCM)、中醫藥綜合數據庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID)等數據庫并結合國家知識基礎設施數據庫(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)、PubMed數據庫中的相關文獻，收集CPhGs類的化學成分及靶點信息。通過在TCMSP、ETCM、TCMID數據庫及文獻內檢索，最終確定29個化合物作為候選化合物[15-16]。

1.2 藥物潛在治療靶點的預測及“中藥-活性成分-靶標”網絡圖的構建 將檢索得到成分的SDF格式文件導入PharmMapper數據庫，進行潛在靶點的預測分析，并采用UniProt KB搜索功能對靶點名稱進行校正。運用Cytoscape 3.8.0軟件構建“中藥-活性成分-靶點”網絡圖。

1.3 HCC相關基因的篩選 將“Hepatocellular Carcinoma”“HCC”作為關鍵詞在以下4個數據庫中進行檢索，獲得HCC靶點的信息：1)OMIM數據庫；2)DrugBank數據庫；3)GeneCards數據庫；4)治療靶點數據庫(Therapeutic Target Database，TTD，http://db.idrblab.net/ttd)。篩選后將靶點信息進行匯總整理。

1.4 CPhGs治療HCC的靶點映射 通過在線繪圖軟件制作韋恩圖，將CPhGs類成分作用靶點與HCC靶標進行映射，交集靶點即為CPhGs類成分治療HCC潛在作用靶點，通過韋恩圖確定CPhGs類成分與HCC的藥物-疾病交集靶點。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡的構建 利用STRING數據庫(https://string-db.org/)進行共有靶點的PPI分析，設置Combined Score>0.4，并將結果利用Cytoscape 3.8.0進行拓撲分析，以度值大于中位數的2倍篩選出關鍵共有靶點。

1.6 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 利用DAVID數據庫對CPhGs和HCC共同作用靶點蛋白進行GO分析和KEGG通路富集分析，設定閾值P≤0.05，篩選出具有顯著性差異的生物過程和通路，并通過Cytoscape 3.8.0軟件構建“中藥-活性成分-靶點-通路”網絡。

1.7 核心靶點的分子對接驗證 選擇關鍵靶點蛋白用于分子對接，從RCSBPDB數據庫獲取這些靶點蛋白的晶體結構文件，從PubChem數據庫獲取這些靶點的活性成分的結構文件，利用Autodock_vina軟件計算靶點蛋白與活性成分間的最低結合能并將分子對接模擬驗證結果進行可視化。

2 結果

2.1 肉蓯蓉苯乙醇總苷的活性成分及其預測靶點 最終確定29個化合物作為候選化合物，包括Echinacoside、Acteoside、Isoacteoside、2′-Acetylacteoside、Tubuloside A等基本信息。見表1。通過數據庫及PharmMapper預測出成分的靶標并去重后，獲得410個可能的靶標。

表1 肉蓯蓉苯乙醇苷類成分基本信息

2.2 “中藥-活性成分-靶標”網絡構建與分析 “中藥-活性成分-靶標”網絡涉及439個節點，7 515條邊。圖中白色節點為中藥；圖中黃色節點中的縮寫為成分名稱，如PhGs9為Acteoside，其余略；圖中藍色節點為靶標名稱，如CASP3為Caspase-3蛋白。見圖1。

圖1 CPhGs類成分“中藥-活性成分-靶標”網絡

2.3 HCC疾病靶點的獲取及CPhGs類成分靶點映射 共獲得HCC相關靶點1 944個。通過韋恩圖將CPhGs成分預測的靶點與HCC的靶點進行映射，發現共有173個交集靶點，即CPhGs治療HCC的作用靶點。見圖2。

圖2 CPhGs-HCC共同靶點數

2.4 PPI網絡構建及分析 CPhGs治療HCC的靶點蛋白PPI網絡涉及173個節點，2 202條邊。見圖3。度值中位數為20，根據度值大于中位數2倍篩選出核心網絡蛋白29個，包括ALB、AKT1、EGFR、MAPK1、IGF1、SRC、CASP3、MMP9、HRAS、HSP90AA1、MAPK8、ESR1、MMP2、RHOA、MAPK14、ANXA5、CAT、MDM2、KDR、PIK3R1、CDC42、MAP2K1、STAT1、GRB2、AR、IL-2、NOS3、IGF1R、JAK2。以上靶點在PPI網絡中的位置，表明其在CPhGs治療HCC中可能發揮重要作用。見圖4。

圖3 CPhGs治療HCC潛在作用靶點之間的相互作用網絡

圖4 PPI核心基因柱狀圖

2.5 GO分類富集分析和KEGG通路富集分析 將篩選出的29個關鍵靶點進行GO和KEGG富集分析，得到生物過程(Biological Process，BP)65條，主要包括蛋白質磷酸化，細胞增殖、遷移、凋亡，腎上腺素信號通路等；細胞組分(Cellular Components，CC)18條，主要與細胞質，細胞間連接，細胞內外基質等有關；分子功能(Molecular Function，MF)23條，主要與蛋白激酶活性、蛋白質結合、酶結合等有關。見圖5。以上數據P值均小于0.05。通過KEGG富集得到92條信號通路(P<0.05)，主要涵蓋癌癥信號通路(hsa05200：Pathways in Cancer)、癌癥蛋白聚糖通路(hsa05205：Proteoglycans in Cancer)、PI3K-AKT信號通路(hsa04151：PI3K-AKT Signaling Pathway)、RAS信號通路(hsa04014：Ras Signaling Pathway)、FoxO信號通路(hsa04068：FoxO Signaling Pathway)、血管內皮生長因子信號通路(hsa04370：VEGF Signaling Pathway)等，排名前20的通路。見圖6。

圖5 CPhGs潛在靶標的GO富集分析

圖6 CPhGs潛在靶標的KEGG通路富集分析

2.6 “中藥-活性成分-靶點-信號通路”網絡構建 CPhGs治療HCC的“中藥-活性成分-靶點-通路”網絡共有79個節點和901條邊，涉及29種活性成分、29個關鍵靶點、20條KEGG通路，體現了CPhGs可能通過多成分、多靶點、多途徑發揮多效應的特點。見圖7。

圖7 CPhGs成分治療HCC的“中藥-活性成分-靶點-信號通路”網絡圖

2.7 分子對接驗證 根據“中藥-活性成分-靶點”網絡中靶點的度值選擇CPhGs活性成分5個(毛蕊花糖苷、松果菊苷、2-乙酰毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A)與PPI分析中度值排名前10的靶點蛋白(ALB、AKT1、EGFR、MAPK1、IGF1、SRC、CASP3、MMP9、HRAS、HSP90AA1)進行分子對接，篩選對接結果中結合能低的分子構象即為最優對接結果，其中活性成分與蛋白間的結合能等信息。見表2。具體對接過程見圖8。結果顯示，50個對接結果均有較優的(Total Score≤-5.0)對接活性，其中，43個對接結果有強烈的匹配活性(Total Score≤-7.0)。以上對接結果充分表明，CPhGs活性組分與HCC關鍵核心靶基因的結合作用良好。

表2 活性成分與靶點蛋白結合能(kcal/mol,1 cal=4.184 J)

圖8 靶點受體蛋白與活性成分的分子對接模式

3 討論

HCC是嚴重威脅人類健康的十大惡性腫瘤之一，具有發病隱匿，進展迅速，治療困難、轉移概率高的特點[17]。HCC是各種信號通路及細胞因子共同參與的病理生理過程，因此單靶點、單通路治療很難起效。中藥具有多成分、多作用靶點和作用途徑復雜等特點，并以“人”為核心，將整體與局部相關聯，通過中藥有效成分在體內的代謝過程，進而從系統上實現藥物對機體的調控。

通過“中藥-活性成分-靶點”的網絡結果顯示，CPhGs類成分毛蕊花糖苷、松果菊苷、紅景天等均具有較高的防治肝癌活性，在治療過程中可能發揮重要作用。毛蕊花糖苷對環境、飲食及二乙基亞硝胺誘導的大鼠肝癌具有預防作用，其發揮作用可能是由信號轉導及轉錄激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT)3依賴性的氧化應激和凋亡調控介導的[18]。另外，毛蕊花糖苷可通過干擾JNK信號通路的激活和調控自噬蛋白的表達來抑制肝癌細胞的增殖[19]。研究表明，松果菊苷(ECH)能抑制二乙基亞硝胺誘導的小鼠肝癌，并對HepG2肝癌細胞株具有抗增殖和促凋亡作用，其作用機制可能是通過降低骨髓細胞觸發受體2(Triggering Receptors Expressed on Myeloid Cells 2，TREM2)的表達和PI3K/AKT信號通路發揮其抗腫瘤活性[20]。紅景天苷聯合奧沙利鉑給藥可以提高HCC患者的化療療效，通過抑制HIF-1α信號通路，顯著提高HCC患者對鉑類藥物的敏感性，抑制缺氧誘導的上皮-間充質轉化(Epithelial Mesenchymal Transformation，EMT)[21]。

綜上所述，目前針對CPhGs類成分防治HCC的作用機制研究較少，尚未見有關CPhGs防治HCC作用機制的報道。基于此，本課題應用網絡藥理學及分子對接技術對CPhGs防治HCC的作用機制進行系統研究，豐富和完善中藥、天然藥物治療HCC的研究資料，拓展新疆地產藥材肉蓯蓉的開發應用價值。

本研究的PPI網絡拓撲學分析顯示，CPhGs治療HCC的核心靶點有29個，其中包括AKT1，PIK3R1，STAT1，SRC，MAPK1，CASP3，MAPK8，MAPK14，IGF1R等，均涉及細胞凋亡和細胞增殖過程。采用DAVID數據庫對上述29個關鍵靶點進行GO功能和KEGG富集分析。GO功能富集分析結果顯示CPhGs可以對細胞信號轉導、細胞遷移、細胞增殖、細胞免疫等生物過程起調控作用，涉及細胞膜、核、質、細胞器膜及細胞空間等細胞組成過程，并通過與蛋白、酶各類受體結合等分子功能產生活性。KEGG功能富集分析結果顯示，CPhGs防治HCC可能是通過調控癌癥信號通路、癌癥蛋白聚糖通路、PI3K/AKT信號通路、GnRH信號通路等多條信號轉導通路，其中均涉及PI3K/AKT信號通路，其作用尤為關鍵。

PI3K/AKT信號通路在肝癌的起始過程中起著至關重要的作用，涉及多種生物學過程，如增殖、轉移、耐藥、抗輻射、能量代謝和自噬等[22-23]。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)是由調節亞單位p85和催化亞單位p110組成的異源性二聚體。根據底物和序列同源性，將PI3K分為3個亞型，都能磷酸化磷脂酰肌醇第3位羥基，從而產生特定的磷酸肌醇形式而發揮作用[24]。蛋白激酶B是位于PI3K下游的靶蛋白，是細胞增殖和存活的重要調節因子。目前，已經鑒定出3種AKT基因，分別稱為AKT1、AKT2和AKT3。抑制AKT活性可誘導一系列哺乳動物的細胞凋亡，因此，將蛋白激酶B抑制劑與抗癌藥物聯合治療具有突變的腫瘤有一定的療效[25]。

本研究將“中藥-活性成分--靶點”網絡中排名前5的核心活性化合物與PPI分析中度值排名前10的蛋白靶點進行分子對接，進一步明確其發揮效用的治療機制。采用Autodock vina進行對接，選取親和力最佳的構象，其中最低結合能≤-5.0 kcal/mol即表明藥效分子與蛋白對接效果良好,結合能越低，表明分子與蛋白結合能力越佳。本研究結果提示肉蓯蓉中的苯乙醇苷類活性化合物與蛋白激酶B1、HSP90AA1等靶標結合后最低結合能均≤-5.0 kcal/mol，表明其具有較強的結合能力，充分驗證了網絡藥理學的預測結果。蛋白激酶B是一種人類絲氨酸-蘇氨酸激酶，是AGC蛋白激酶家族的成員[26]。蛋白激酶B在大多數癌癥類型中都高度表達，包括HCC、肺癌、乳腺癌和以及結腸癌，其中蛋白激酶B1是治療癌癥的主要藥物靶點，在細胞增殖和抗凋亡的過程中發揮作用。有研究表明沉默蛋白激酶B1能夠抑制腫瘤生長和誘導細胞凋亡，并可有效上調腫瘤抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的表達、減少Notch1的表達，靶向蛋白激酶B1可以抑制HCC的發展[27]。熱激蛋白90α(Heat Shock Protein 90α，Hsp90α)由HSP90AA1基因編碼，是分子伴侶Hsp90的誘導亞型，是真核生物中高度保守且必不可少的伴侶蛋白[28]。HSP90已成為治療癌癥中的關鍵目標，Hsp90與多種促進腫瘤發生的蛋白相互作用，因此，Hsp90是一個重要的致癌因子。研究表明，HCC患者血清HSP90AA1水平明顯高于健康對照組[29]，分泌型HSP90AA1可能是HCC良好的生物標志物，被批準用于中國HCC的臨床診斷[30]。

綜上所述，本文以CPhGs主要活性成分為研究對象，通過網絡藥理學技術分析其潛在的防治HCC靶點及信號通路，并結合分子對接方法初步驗證了CPhGs主要活性成分能與HCC靶點發生相互作用，為進一步深入探討其作用機制奠定了基礎。