基于Wnt/β-連環素通路探討補骨脂素對骨質疏松癥大鼠的影響

王 健 張 馳

(遼寧中醫藥大學附屬醫院骨傷科，沈陽，110032)

骨質疏松癥(Osteoporosis，OS)是一種全身骨代謝障礙性疾病，以骨量減少、骨微細結構破壞、骨脆性增加等為主要的病理改變[1]，容易引發骨折而致殘、致死，給患者造成很大痛苦。OS主要分為絕經后、繼發性以及特發性3種，其中以絕經后OS最為常見。該病好發于50歲以上人群，據統計，全球骨質疏松患者約2億，美國絕經后女性中30%左右患OS[2]，我國作為老年人口最多的國家，OS患病率不斷上升，50歲以上女性患病率已經高達20.7%，而這些患者中50%有可能出現骨折[3]。雌孕激素、選擇性雌激素受體調節劑、雙磷酸鹽等骨吸收抑制劑，以及氟制劑、甲狀旁腺激素等骨形成促進劑，以及骨化三醇、鈣劑等骨礦化藥物是臨床上治療OS的主要藥物[4]，但長期使用不良反應明顯。因此，國內醫學界將新藥研究的重點放在了安全性相對較高的中藥制劑。補骨脂是治療OS的常用補益中藥，具有較好的抗骨質疏松作用[5]，但究竟該藥何種成分如何發揮作用目前尚未明確。本研究從對Wnt/β-連環素(β-Catenin)信號通路的影響出發，探討補骨脂主要活性成分補骨脂素對去勢大鼠OS的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取12周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級健康雌性SD大鼠78只，體質量240～280 g，平均體質量(262.64±10.93)g，購自中國醫學科學院醫學生物學研究所，動物許可證號：SCXK(滇)K2014-0002。該研究經遼寧中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準(倫理審批號：20170311)。將大鼠分籠飼養，每籠4只，飼養室內安靜，溫度設定為19～23 ℃，相對濕度設定為45%～55%，定時通風換氣，晝夜節律為12 h/12 h，飼以普通標準飼料和無菌過濾水，大鼠在籠內自由活動，每周更換墊料2～3次并嚴格消毒。

1.1.2 藥物 補骨脂素(安徽永純生物技術有限公司，貨號：YC-0139)，CAS號：66-97-7，純度：用高效液相色譜檢測含量≥98%，規格：10 mg/支，使用時用二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)溶解，雙蒸水稀釋配制成濃度為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL的補骨脂素溶液，現用現配；阿侖膦酸鈉片杭州默沙東制藥有限公司，批號：20170321)，規格：10 mg/片，使用時研碎成末，用DMSO溶解，雙蒸水稀釋配制成濃度為0.2 mg/mL的阿侖膦酸鈉溶液，現用現配；注射用青霉素鈉(桂林南藥股份有限公司，批號：20170402)，規格：每支80萬單位。

1.1.3 試劑與儀器 DMSO(北京凱瑞基生物科技有限公司，批號：201700526)；戊巴比妥鈉(湖北鴻運隆生物科技有限公司，批號：20170418)；大鼠護骨因子(Osteoprotegerin，OPG)、骨鈣蛋白(Osteocalcin，BGP)酶聯免疫吸附試驗試劑盒(無錫市東林科技發展有限責任公司，批號：20170602/20170722)；OPG、BGP免疫組化試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司，批號：20170704/20170629)；二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：20170421)；總RNA抽提試劑盒(Trizol法)(上海康朗生物科技有限公司，批號：20170317)；cDNA第一鏈合成試劑盒(深圳子科生物科技有限公司，批號：20170519)；低密度脂蛋白受體相關蛋白6(Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 6，Lrp6)、糖原合酶激酶-3β(Glycogen Synthase Kinase-3,GSK-3β)、β-連環素(β-catenin)、Runt相關轉錄因子2(Runx2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)上游引物、下游引物合成(無錫英紐瑞生物醫藥科技有限公司，批號：20170427、20170409、20170418、20170329、20170506)。小動物雙能X射線骨密度儀(MEDIKORS公司，韓國，型號：InAlyzer型)，Micro-CT小動物活體影像系統(PerkinElmer公司，美國，型號：Quantum GX型)，離心機(Thermo Scientific公司，美國，型號：Sorvall ST 40R型)，全自動酶聯免疫吸附分析儀(Tecan公司，瑞士，型號：Freedom EVO 75型)，核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司，德國，型號：BioPhotometer D30型)，實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國，型號：iQ5型)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 經1周適應性飼養后，將所有大鼠編號，之后按隨機數字表法分為對照組13只及造模組65只。所有大鼠均禁食12 h，不禁水，稱重后給予0.2%戊巴比妥鈉溶液10 mL/g，腹腔注射以麻醉大鼠，麻醉滿意后將大鼠仰臥位固定于手術臺上，下腹部常規備皮、消毒、鋪巾，于腹白線處作長度為2 cm的縱切口，逐層打開腹腔，造模組暴露兩側卵巢組織并切除，將卵巢周圍的血管以及輸卵管結扎；對照組大鼠僅暴露卵巢而不行切除術；依次縫合傷口，消毒。所有大鼠給予青霉素，每天10萬單位，腹腔注射，連續7 d以預防感染。手術12周后，采用InAlyzer型小動物雙能X射線骨密度儀測定大鼠4、5腰椎及左、右股骨骨密度(Bone Mineral Density，BMD)，造模組BMD值低于對照組，差異有統計學意義，即為骨質疏松模型建立成功[6]。實驗過程中意外死亡或造模失敗的大鼠及時予以補充。然后將造模成功大鼠隨機分為模型組、阿侖膦酸鈉組及補骨脂素低、中、高濃度組，每組13只。

1.2.2 給藥方法 模型組及對照組分別給予雙蒸水5 mL/kg灌胃；阿侖膦酸鈉組給予0.2 mg/mL阿侖膦酸鈉溶液5 mL/kg灌胃，1次/周；補骨脂素低、中、高濃度組分別給予0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL的補骨脂素溶液5 mL/kg灌胃。各組大鼠均給藥12周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 大鼠BMD檢測 末次給藥第2天，稱重后0.2%戊巴比妥鈉溶液15 mL/g，腹腔注射以麻醉大鼠，采用In Alyzer型小動物雙能X射線骨密度儀檢測大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD。

1.2.3.2 Micro-CT測定大鼠骨形態學指標 BMD檢測完成后，采用Quantum GX型Micro-CT小動物活體影像系統掃描大鼠右側股骨，掃描參數為：電壓60 kV，功率40 W，4幀，每轉0.72°；用配套軟件進行整體和局部重建，截取二維、三維及局部骨小梁圖片，同時分析測定骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁數量(Tb.N)。

1.2.3.3 酶聯免疫吸附試驗法檢測血清OPG、BGP水平 Micro-CT檢測完成后，打開腹腔，自腹主動脈取血4 mL，置于含有肝素的抗凝管內，1 200×g離心10 min，分離血清，保存于-80 ℃冰箱內備檢；取凍存的血清，迅速解凍并恢復至室溫，按照酶聯免疫吸附試驗法檢測試劑盒說明書進行操作，采用Freedom EVO 75全自動酶聯免疫吸附分析儀，通過酶聯免疫吸附試驗法檢測血清OPG、BGP水平[7]。

1.2.3.4 免疫組織化學法檢測大鼠骨組織OPG、BGP水平 處死大鼠，取雙側股骨組織，其中左股骨組織用10%中性甲醛進行固定，然后采用脫鈣劑進行脫鈣[8]，常規脫水、透明、石蠟包埋，制成厚度為5 μm的石蠟切片→常規采用二甲苯脫蠟→梯度濃度乙醇逐級水化→3%過氧化氫處理20 min，使內源性過氧化氫酶消除→磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)。洗片3次，5 min/次→胰蛋白酶處理切片30 min→PBS洗片3次，5 min/次→根據免疫組織化學試劑盒，采用1∶1 000稀釋的兔抗OPG、BGP一抗處理切片，室溫2 h→PBS洗片3次，5 min/次→1∶2 000稀釋的二抗處理切片，室溫30 min→PBS洗片3次，5 min/次→試劑盒內的卵白素-生物素-酶復合物染色(ABC)試劑處理切片1 h→PBS洗片3次，5 min/次→用DAB顯色試劑盒使切片顯色→常規脫水、透明、中性樹脂封固。在光學顯微鏡下對染色結果進行觀察，OPG、BGP表達陽性的細胞被染成棕黃色，每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)采集圖像，用Image J軟件分析OPG、BGP蛋白表達的平均光密度值(IOD)[7]。

1.2.3.5 實時定量PCR法檢測大鼠骨組織Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表達水平 右股骨組織用生理鹽水浸濕，保存于-80 ℃冰箱內→將凍存的股骨組織剪碎后液氮研磨成粉→加入TRIzol溶液，充分勻漿10 min→按照RNA抽提試劑盒的說明操作提取總RNA→用焦碳酸二乙酯水溶解RNA→采用BioPhotometer D30型核酸蛋白測定儀檢測總RNA濃度和純度→按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明操作，把RNA逆轉錄成為cDNA→于冰上配制PCR液(含SYBR熒光染料10 μL+Lrp6 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、Runx2 mRNA以及內參GAPDH上、下游引物各0.4 μL+cDNA模板2 μL+滅菌蒸餾水2 μL)→采用iQ5型實時熒光定量PCR儀進行引物擴增，反應條件為：95 ℃預變性5 min，40個循環(95 ℃，15 s→60 ℃，15 s→72 ℃，32 s)→獲得Lrp6 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、Runx2 mRNA以及內參GAPDH生成溶解曲線，計算Lrp6 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、Runx2 mRNA的相對表達量[9]。

2 結果

2.1 各組大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD比較 與對照組比較，模型組大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD均較高，且補骨脂素低濃度組<補骨脂素中濃度組<補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD比較

2.2 各組大鼠Tb.Sp、Tb.Th及Tb.N比較 與對照組比較，模型組大鼠Tb.Sp顯著升高，Tb.Th、Tb.N明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠Tb.Th、Tb.N均較高，且補骨脂素低濃度組<補骨脂素中濃度組<補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠Tb.Sp均較低，且補骨脂素低濃度組>補骨脂素中濃度組>補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2,圖1。

表2 各組大鼠Tb.Sp、Tb.Th及Tb.N比較

圖1 各組大鼠骨組織形態學Micro-CT觀察結果

2.3 各組大鼠血清OPG、BGP水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清BGP水平顯著升高，OPG水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠血清OPG水平均較高，且補骨脂素低濃度組<補骨脂素中濃度組<補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠血清BGP水平均較低，且補骨脂素低濃度組>補骨脂素中濃度組>補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清OPG、BGP水平比較

2.4 各組大鼠骨組織OPG、BGP表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠骨組織BGP表達水平顯著升高，OPG表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠股骨組織OPG表達水平均較高，且補骨脂素低濃度組<補骨脂素中濃度組<補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠股、骨組織BGP表達水平均較低，且補骨脂素低濃度組>補骨脂素中濃度組>補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖2、3。

表4 各組大鼠股、骨組織OPG、BGP表達水平比較

圖2 各組大鼠骨組織OPG表達結果(免疫組織化學染色，×400)

圖3 各組大鼠骨組織OPG表達結果(免疫組織化學染色，×400)

2.5 各組大鼠骨組織Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠骨組織GSK-3β mRNA表達水平顯著升高，骨組織Lrp6、β-catenin、Runx2 mRNA水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織Lrp6、β-catenin、Runx2 mRNA表達水平均較高，且補骨脂素低濃度組<補骨脂素中濃度組<補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織GSK-3β mRNA表達水平較低，且補骨脂素低濃度組>補骨脂素中濃度組>補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 各組大鼠骨組織Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表達水平比較

圖4 各組大鼠骨組織Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表達結果

3 討論

中醫認為，OS屬于“骨痿”“腰痛”“骨痹”“骨枯”等范疇[10]，屬于本虛標實之證，本虛為肝腎氣血虧虛，標實為痰飲、瘀血、氣滯，腎主骨生髓，腎精虧虛則骨髓生長乏源，骨骼失于濡養，致骨枯骨痿，腎虛日久出現瘀血、氣滯等，可影響骨的氣血運行，進一步加重病情，骨治療上應以補腎為主，兼以活血行氣。補骨脂屬于補益藥，味辛苦，性大溫，歸腎、脾經，有補腎壯陽、溫脾止瀉等功效，臨床應用廣泛。劉振海等[11]研究發現，補骨脂常作為中藥復方中的一味藥用于肝腎不足型OS的治療。現代藥理研究顯示，補骨脂內含有香豆素類、單萜酚類、黃酮類等多種活性成分，具有升高白細胞延緩老年癡呆進程、改善細胞免疫功能、抗骨質疏松、抗腫瘤、調節腎上腺皮質功能、抗菌抗病毒等多種藥理作用[12]。補骨脂素為補骨脂中的呋喃香豆素類化合物，被認為是補骨脂內抗骨質疏松的主要有效成分，楊琳等[13]研究發現，補骨脂素能通過上調骨組織轉化生長因子-β的表達水平，來促進骨形成過程，發揮對去勢骨質疏松雌鼠的治療作用。邢貞武[14]的體外研究則發現，補骨脂素能夠激活骨髓間充質干細胞的Notch信號通路，促進成骨細胞分化，從而影響絕經后骨質疏松發展。由此可見，補骨脂素可以通過多種途徑發揮抗骨質疏松作用，但具體機制尚未完全明確，需要更全面地進行研究。

本研究采用不同濃度的補骨脂素對去勢OS大鼠模型進行治療，結果發現，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD及骨組織Tb.Th、Tb.N均較高，Tb.Sp均低于模型組，且藥物濃度越高，變化幅度越大，BMD是評價OS治療效果的主要指標，Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp等骨形態學指標則可反映骨微細結構的變化，該結果表明補骨脂素能夠有效增加OS大鼠BMD，同時改善骨組織的微細結構和骨強度，且補骨脂素濃度越高作用效果越好。血清骨代謝相關指標研究結果顯示，補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠血清及骨組織OPG水平高于模型組，BGP水平低于模型組，且補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組改變最為明顯，骨質疏松的發生是骨形成與骨吸收失衡的結果，BGP由成骨細胞合成分泌，為骨轉換標志，能夠反映骨更新率，絕經后OS屬于高轉換型，故該病發生后BGP處于較高水平；OPG是由成骨細胞分泌的糖蛋白，抑制破骨細胞分化、成熟并誘導其凋亡，從而抑制骨吸收，加速骨形成，發揮骨保護作用[15]。該結果表明高濃度的補骨脂素能夠有效調節骨形成和骨吸收過程，保護骨組織。

Wnt/β-catenin信號通路是骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的重要途徑，能影響成骨細胞活性和功能，參與骨形成和骨代謝過程[16-17]，在骨質疏松的發生發展過程中也起到重要作用。Lrp6、GSK-3β和β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的主要分子，一般認為，Wnt/β-catenin信號通路被激活后，細胞膜上的Wnt能夠與Lrp6特異性結合，形成的復合體可以促使GSK-3β磷酸化并喪失活性，無法促進β-catenin磷酸化，從而引起細胞內β-catenin積聚，然后進入細胞核內，控制相關基因轉錄，激活Wnt下游靶基因Runx2，Runx2為骨形成和發育的必要基因[18-21]，能調節成骨細胞分化并促進其成熟。若Wnt/β-catenin信號通路被抑制，則成骨細胞分化受到影響，可導致骨質疏松發生。本研究發現補骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織Lrp6、β-catenin、Runx2 mRNA表達水平高于模型組，GSK-3β mRNA表達水平低于模型組，且補骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組變化最明顯，表明補骨脂素能通過激活Wnt/β-catenin信號通路來促進成骨細胞分化，這可能是補骨脂素發揮抗骨質疏松的作用機制之一。

綜上所述，補骨脂素能劑量依賴性地提高OS大鼠的BMD，提高血清及骨組織BGP水平，降低BGP水平，增加骨組織骨小梁厚度和數量，降低骨小梁分離度，其作用可能與激活Wnt/β-catenin信號通路有關。