ELISA抗體檢測試劑盒與病毒中和試驗對臨床牛血清樣本中牛結節性皮膚病病毒抗體的檢測比對

朱 真，李 靜，張 蕾，董春娜，李鵬宇，杜吉革，石守定，肖 進，陳小云

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 海淀 100081；2.中牧實業股份有限公司 農業部獸用生物制品與化藥重點實驗室 北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術中心，北京 海淀 100095；3.中國畜牧業協會，北京 西城 100044)

牛結節性皮膚病(Lumpy skin disease，LSD)是由痘病毒科羊痘病毒屬的牛結節性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的急性傳染性疾病，該病可感染任何年齡階段、任何品種的牛，引起廣泛的皮膚病變和典型的全身型痘病毒感染癥狀，嚴重時可導致死亡，其中犢牛死亡率可達100%，成年牛的死亡率在3%～10%，被世界動物衛生組織(World Organization for Animal Health，OIE)列為必須通報的動物傳染病[1]，我國將其列為二類動物疫病。

2019年8月12日，經中國動物衛生與流行病學中心國家外來動物疫病研究中心確診，新疆維吾爾自治區伊犁州發生LSD疫情，這是我國首次確診該病[2]。2020年6月5日—7月12日，農業農村部通報了6起LSD疫情[3]。我國鄰國俄羅斯、泰國等國家時常發生LSD疫情，給我國的養牛業帶來了巨大的威脅[4]。目前，LSD已在我國多地呈逐漸流行趨勢，嚴重危害我國的養牛業。

本研究使用中牧實業股份有限公司制備的3批牛結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒產品對臨床采集的260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清進行檢測，并與病毒中和試驗(Virus neutralization test,VNT)檢測結果進行比較，以期為LSDV抗體水平檢測提供合理的檢測手段，為免疫程序的制定以及疫病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測試劑盒 牛結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒，采用LSDV多種免疫優勢抗原肽作為包被抗原，由中牧實業股份有限公司制備，試劑盒批號分別為LSDV-1、LSDV-2和LSDV-3。

1.1.2 待檢血清 共460份血清，均經65 ℃30 min滅活后，從中國獸醫藥品監察所生物安全三級實驗室(The biological safety level-3 laboratory,BSL-3)移出。按照中華人民共和國國家標準《牛結節性皮膚病診斷技術》(GB/T 39602—2020)[5]中規定的PCR方法，對460份血清進行PCR檢測，均為LSDV抗原陰性，可用于ELISA抗體檢測。

1.1.2.1 感染牛血清 260份，編號I 1～I 260，為LSDV臨床發病牛血清，采自吉林、山東、河北等疫區，由中國獸醫藥品監察所提供。

1.1.2.2 健康牛血清 200份，編號Y 1～Y 200，采集自臨床未免疫山羊痘活疫苗且牛結節性皮膚病抗原檢測為陰性的健康牛，由中牧實業股份有限公司提供。

1.1.3 細胞 山羊睪丸原代細胞，F4代，由中國獸醫藥品監察所動物實驗室制備和保存。

1.1.4 病毒 牛結節性皮膚病病毒(LSDV ZJS01株)，F2代細胞毒，由中國獸醫藥品監察所制備和保存。

1.2 方法

1.2.1 ELISA方法 以LSDV多種免疫優勢抗原肽作為包被抗原，建立間接ELISA方法。(1)在血清稀釋板中將待檢血清進行適當稀釋，陰性和陽性對照血清已稀釋，可直接使用。(2)取抗原包被板，將稀釋好的待檢血清、陽性對照血清和陰性對照血清加入到抗原包被板中，100 μL/孔。每份待檢血清設1孔，陽性對照血清和陰性對照血清各設2孔，加樣過程時間跨度應盡量短。振蕩混勻(勿溢出)，置37 ℃溫箱內孵育30 min。(3)棄去反應液，每孔加入洗滌液300 μL，連續洗板5次后拍干。(4)各孔加入已稀釋至工作濃度的HRP-抗牛IgG 100 μL，置37 ℃溫箱內孵育30 min。(5)棄去反應液，每孔加入洗滌液300 μL，連續洗板5次后拍干。(6)每孔加入100 μL底物工作液(將底物液A和底物液B等量混合即為底物工作液，現用現配)，振蕩混勻，置37 ℃溫箱內避光反應15 min。(7)各孔加入顯色終止液50 μL，振蕩混勻終止反應，15 min內測定結果。(8)試驗成立的條件：陽性對照孔OD450 nm值應介于1.0～2.2，陰性對照孔OD450 nm值均應≤0.15。(9)判定標準：臨界值(Cut-off值)=陽性對照孔OD450 nm均值×0.15；待檢血清測定OD450 nm值≥臨界值者判為陽性；待檢血清測定OD450 nm值<臨界值者判為陰性。

1.2.2 VNT方法 于中國獸醫藥品監察所ABSL-3實驗室開展VNT檢測。(1)對于260份LSDV感染牛血清，用MEM細胞生長液將待檢血清進行連續倍比稀釋，從1∶2至1∶256，每個稀釋度重復3孔，每孔125 μL。(2)對于200份健康牛血清，用MEM細胞生長液將待檢血清進行1∶2稀釋，重復2孔，每孔125 μL。(3)用MEM細胞生長液將已測定半數組織培養感染劑量(Tissue culture infective dose,TCID50)的LSDV病毒液稀釋為200 TCID50/0.1 mL，將稀釋好的病毒液加入到血清稀釋孔中，每孔125 μL，置37 ℃含5% CO2的培養箱中作用1 h。(4)將中和后的血清—病毒混合液接種于已長成良好單層山羊睪丸原代細胞的96孔細胞培養板中，每個稀釋度重復3孔，每孔0.2 mL，置37 ℃含5% CO2的培養箱中培養。同時設陰性血清對照、病毒對照和正常細胞對照。(5)每日觀察記錄細胞病變效應(Cytopathic effect,CPE)情況，直至細胞穩定，一般需96～120 h，按Reed-Muench法計算被檢血清中病毒中和抗體效價[6]。

2 結果

2.1 牛結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒檢測 3批牛結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒對260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的檢測結果見表1，3批牛結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒對260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的陰陽性判定結果一致。對260份LSDV感染牛血清的檢測敏感性為86.9%(226/260)，對200份健康牛血清的檢測特異性為100%(200/200)。

表1 LSDV感染牛血清和健康牛血清的ELISA檢測結果

2.2 VNT檢測 對260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的檢測結果見表2和表3，VNT方法對260份LSDV感染牛血清的檢測敏感性為81.9%(213/260)，對200份健康牛血清的檢測特異性為100%(200/200)。

表2 LSDV感染牛血清和健康牛血清的VNT檢測結果

表3 LSDV感染牛血清和健康牛血清的VNT檢測結果匯總

2.3 牛結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒與VNT的檢測符合率 2種方法對260份LSDV感染牛血清的檢測結果均為陽性的為201份，均為陰性的為22份，檢測符合率為85.8%(223/260)，見表4。2種方法對200份健康牛血清的檢測符合率為100%(200/200)，見表5。

表4 ELISA與VNT檢測LSDV感染牛血清的符合率

表5 ELISA與VNT檢測健康牛血清的符合率

3 討論

LSD是一種病毒性傳染病，與我國接壤的蒙古、老撾、馬來西亞、柬埔寨、斯里蘭卡和泰國等國家一直有LSD疫情發生[7-12]，我國于2019年8月12日首次確診LSD疫情[2]，隨后我國多省均發生LSD疫情[13]。該病主要發生于吸血蟲媒活躍的季節，多通過吸血昆蟲(蚊、蠅、蠓、虻、蜱等)叮咬傳播[14]。該病的傳播和流行給我國養牛業帶來了巨大的威脅，造成嚴重的經濟損失，可造成病牛消瘦、產奶量急劇下降、皮膚結節處出現凹陷或空洞，使其經濟價值降低。結合LSDV依靠吸血蟲媒叮咬傳播的特性、頻繁的動物貿易以及鄰國之間的染疫動物的遷徙，將進一步增加LSD的防控難度，我國短期內不會根除LSD[15-16]。

目前我國對于LSD的防控措施主要是撲殺。省級農業農村部門可根據轄區內動物疫病流行情況，對牛結節性皮膚病實施強制免疫[14]。目前國內沒有LSD疫苗，根據《牛結節性皮膚病防治技術規范》[14]要求，對疫情危險區縣采取山羊痘活疫苗免疫(按山羊5倍劑量)。因此建立一種快速、準確的抗體水平檢測方法對免疫程序的制定以及疫病防控具有重要的意義。

OIE推薦的用于LSD的血清學診斷方法包括VNT、ELISA、間接熒光抗體試驗(Indirect fluorescence antibody test,IFAT)、免疫印跡試驗(Western blot,WB)等[17]。VNT是血清學檢測的金標準，但由于VNT試驗中需要接觸LSDV活病毒，必須在有資質的 BSL-3實驗室開展相關試驗，且對試驗操作要求較高，不適于進行現場大量血清的檢測。IFAT方法也需要接觸LSDV活病毒，必須在BSL-3實驗室開展試驗。有研究表明，IFAT方法檢測LSDV血清抗體特異性略差，易與羊口瘡病毒等發生交叉反應，而且結果判定較為主觀[18-19]。WB用于檢測LSDV的P32抗原，具有很好的敏感性和特異性，但由于其操作繁瑣、耗時較長，限制了其在臨床上的廣泛應用[20]。ELISA方法是市場上主流的免疫測定技術，具有敏感性好、特異性高、操作簡單等優點，已廣泛應用于臨床檢測。

本研究采用的牛結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒由中牧實業股份有限公司研制，該ELISA方法為基于LSDV多種免疫優勢抗原的合成肽作為包被抗原建立的間接ELISA方法，以合成肽抗原作為包被抗原具有以下優勢：(1)合成肽抗原為人工化學合成的多肽，合成中不需要接觸和使用活病毒，不存在生物安全隱患；(2)多肽抗原為針對特定抗原位點設計的，與相應抗體的結合力強；(3)多種優勢抗原肽混合包被，大大增加了試劑盒檢測的敏感性。為了驗證牛結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒與VNT檢測方法之間的符合率，本研究采用3批ELISA試劑盒與VNT方法，同時對260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清進行比對檢測。結果顯示，3批結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒對260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的陰陽性判定結果一致，對260份LSDV感染牛血清的檢測敏感性為86.9%(226/260)，對200份健康牛血清的檢測特異性為100%(200/200)。VNT方法對260份LSDV感染牛血清的檢測敏感性為81.9%(213/260)，對200份健康牛血清的檢測特異性為100%(200/200)。牛結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒與VNT方法對260份LSDV感染牛血清的檢測符合率為85.8%(223/260)，對200份健康牛血清的檢測符合率為100%(200/200)。結果表明，本實驗室研制的牛結節性皮膚病病毒ELISA抗體檢測試劑盒敏感性高、特異性好，可用于LSD抗體檢測。