薏苡仁水提液對試驗性結腸炎小鼠的保護機制

張 濤，周期律，余儒洋，鐘 佳，劉鐘杰，胡宇聲

(1.北京農學院動物科學技術學院，北京 昌平 102206；2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀 100193)

非特異性結腸炎是小動物臨床的常見疾病，屬于炎性腸病的范疇。非特異性結腸炎以反復發(fā)作的消化道癥狀為特征，極易引發(fā)貧血、感染和營養(yǎng)不良等癥狀，嚴重影響動物的壽命和生存質量。現有的研究認為，腸黏膜固有層中免疫細胞數量異常是導致非特異性結腸炎發(fā)病的重要原因之一[1]。腸道固有層中的免疫細胞是維持機體免疫力的基礎，當固有層內免疫細胞數量異常時，會引發(fā)局部免疫抑制或亢進，進而誘發(fā)結腸組織炎癥反應[2]。現有針對非特異性結腸炎的治療以抗炎藥為主，但副作用較為明顯。在中獸醫(yī)視角下，非特異性結腸炎動物的臨床表現往往體現出濕邪致病的特征，故中獸醫(yī)以祛濕健脾為主的療法在臨床中療效較好。薏苡仁作為健脾化濕藥，是治療非特異性結腸炎的常用中藥。含有薏苡仁的方劑或其成分的藥物在臨床觀察和實驗室研究中均被證實可緩解結腸炎癥狀[3-4]。然而，針對薏苡仁單一藥物對結腸炎作用的研究目前少見報道，其發(fā)揮相應作用的機制亦尚不明確。

葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium,DSS)溶液中帶負電荷的硫酸基對腸上皮細胞具有毒性，可導致實驗動物出現與非特異性結腸炎相似的臨床表現和病理變化，因而自由飲用DSS溶液所誘導的試驗性結腸炎模型已成為最常用的研究非特異性結腸炎的動物模型之一[5]。本試驗通過DSS自由飲用方式制備小鼠試驗性結腸炎模型，以疾病活動指數(Disease activity index,DAI)、血清氧化指標和結腸組織病理學評分評估薏苡仁水提液(Coix seed decoction,CSD)對結腸炎小鼠的保護作用，并通過結腸黏膜中T細胞亞群和固有免疫細胞數量的變化，探究CSD可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡昆明小鼠，雌性，體重(35±2)g，清潔級，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。

1.2 主要試劑 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒，購自上海碧云天生物科技有限公司；丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；糞便潛血檢測試劑盒，購自廣東珠海貝索有限公司；CD3 FITC、CD8a PE、CD45 PerCP-cy5.5、CD4 APC、CD11b PE、LY-6G PE-Cy7、F4-80 APC、CD11c FITC、CD45 PerCP-Cy5.5抗體，均購自BioLegend(美國)；DSS，購自北京Coolaber科技有限公司；薏苡仁，購自北京同仁堂藥店。

1.3 主要儀器 流式細胞儀(LSRII型，Becton,Dickinson and Company，美國)；低速離心機(京立離心機有限公司，中國)。

1.4 薏苡仁水提液的制備 取8 g薏苡仁于室溫條件下在雙蒸水中經過浸泡、熬制、定容、加壓過濾等步驟，獲得的200 mL澄清液體即為4%(w/v)CSD，將4% CSD使用3倍體積無菌雙蒸水稀釋，即獲得1%(w/v)CSD。將制備完成的水提液分裝存儲于-80 ℃冰箱中，并于使用前水浴復溫至40 ℃。

1.5 試驗分組及處理 將32只小鼠隨機分為4個組：空白對照(CON)組，模型(DSS)組，高、低濃度薏苡仁水提液(HCSD、LCSD)組。小鼠以組為單位，始終飼養(yǎng)于溫度(25±2)℃，相對濕度55%±10%，晝夜節(jié)律為12 h-12 h的環(huán)境中。本試驗所涉及的動物試驗均獲得中國農業(yè)大學實驗動物福利委員會批準(AW15012020-3)。動物試驗共進行20 d，前10天為預保護期，HCSD組小鼠每日灌胃4% CSD 1 mL/(50 g·bw)，LCSD組小鼠每日灌胃1% CSD 1 mL/(50 g·bw)，CON組和DSS組小鼠每日灌胃生理鹽水1 mL/(50 g·bw)，各組小鼠在預保護期飲用水均為純凈水；后10天為造模期，在維持預保護期用藥方式的基礎上，分別在第11、12、15、16、19天和第20天更換DSS組、LCSD組和HCSD組小鼠飲用水為5%(w/v)DSS，對小鼠進行試驗性結腸炎造模，第13、14、17天和第18天為間歇期，更換此3組小鼠飲用水為純凈水，CON組小鼠在造模期飲用水均為純凈水。在第13、17天和第21天進行DAI評分，從糞便黏稠度、糞便潛血、體重變化3個方面進行評分，總得分即3項評分總和，評分細則見表1。在第21天眼球采血收集小鼠血清后，處死小鼠。每組隨機挑選4只小鼠于結腸中段取3 cm左右結腸組織，沖洗后保存于預冷的 PBS 溶液中，另4只小鼠將腸段沖洗后保存于4%多聚甲醛中，備用。

表1 DAI評分細則

1.6 組織病理學評分 將1.5中所取腸段分別經脫水、包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色等步驟完成切片制作，并于顯微鏡下觀察，組織病理學評分由實驗人員從炎性細胞浸潤程度、皺襞萎縮程度、水腫程度3個方面進行盲法評價，每個指標按嚴重程度分別劃分為0～3分。

1.7 血清氧化指標含量的測定 按照試劑盒說明書分別檢測收集血清中SOD活力和MDA含量。

1.8 流式染色檢測 將1.5中所取結腸組織經剪碎、消化、洗滌、離心、過濾、重懸等步驟后，保存在4 ℃環(huán)境中，使用CD3 FITC、CD8a PE、CD4 APC、CD11b PE、Ly-6G PE-Cy7、F4-80 PerCP-Cy5.5、CD11c FITC、CD45 BV421抗體分別對細胞懸液進行染色，并使用流式細胞儀進行細胞分析。

1.9 數據處理 所有數據均在SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學處理，結果以平均值±標準差表示，并采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗，P<0.05時統(tǒng)計學上有顯著性差異。

2 結果

2.1 CSD對結腸炎小鼠DAI的影響 由圖1可知，與CON組相比，DSS組、LCSD組和HCSD組小鼠在造模過程中DAI均出現顯著上升(P<0.05)；與DSS組相比，LCSD組小鼠第17天DAI評分未出現顯著變化(P>0.05)，其余時間點LCSD組和HCSD組小鼠DAI評分均出現顯著下降(P<0.05)。

圖1 CSD對結腸炎小鼠DAI的影響(n=8)

2.2 CSD對結腸炎小鼠結腸組織病理學評分的影響 由圖2可知，與CON組相比，DSS組小鼠結腸組織學形態(tài)出現明顯改變，組織疏松水腫，皺襞萎縮，淋巴細胞浸潤，血管充血，上皮細胞脫落；而HCSD組和LCSD組受到CSD保護后結腸組織學形態(tài)明顯改善。對各組H.E.染色切片進行組織病理學評分，發(fā)現與CON組相比，DSS組小鼠結腸組織病理學評分顯著增加(P<0.05)；與DSS組相比，HCSD組和LCSD組結腸組織病理學評分顯著降低(P<0.05)。

圖2 CSD對結腸炎小鼠結腸組織病理學評分的影響(n=4)

2.3 CSD對結腸炎小鼠機體氧化損傷的影響 由圖3可知，與CON組相比，DSS組小鼠血清中SOD活力顯著下降(P<0.05)，MDA含量顯著上升(P<0.05)，而與DSS組和CON組相比，LCSD組和HCSD組小鼠血清中SOD活力顯著上升(P<0.05)，MDA含量則顯著下降(P<0.05)。

圖3 CSD對結腸炎小鼠血清氧化指標的影響(n=8)

2.4 CSD對結腸炎小鼠結腸組織中T淋巴細胞亞群分布的影響 由圖4可知，與CON組相比，DSS組結腸組織中CD4+T淋巴細胞占比沒有顯著性差異(P>0.05)；而與CON組和DSS組相比，LCSD組和HCSD組結腸組織中CD4+T淋巴細胞占比顯著增高(P<0.05)；各組之間CD8+T淋巴細胞占比無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 CSD對結腸炎小鼠結腸組織中T淋巴細胞亞群分布的影響(n=4)

2.5 CSD對結腸炎小鼠結腸組織中免疫細胞的影響 由圖5可知，與CON組相比，DSS組小鼠結腸組織中樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的含量均顯著降低(P<0.05)；與DSS組相比，LCSD組和HCSD組小鼠結腸組織中樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的含量均顯著升高(P<0.05)，而與CON組無顯著性差異(P>0.05)。

圖5 CSD對結腸炎小鼠結腸組織中固有免疫細胞的影響(n=4)

3 討論

在本試驗中，造模組小鼠的DAI和組織病理學評分結果表明試驗性結腸炎造模成功，結腸組織形態(tài)變化與之前的報道相一致[6]。DAI結果亦表明，CSD對試驗性結腸炎小鼠的腹瀉、體重減輕、糞便隱血等典型癥狀具有緩解作用。為進一步明確CSD對試驗性結腸炎發(fā)揮保護作用的機制，本試驗分析了與結腸炎癥密切相關的氧化應激指標[7]。機體抗氧化與促氧化之間失衡且傾向于促氧化就會導致氧化應激，隨之而來的氧化損傷被認為是炎癥損傷機體的重要原因之一[8]。SOD是動物機體內廣泛存在的一類抗氧化酶，能夠催化超氧化陰離子降解，從而起到減輕氧化損傷的作用[7]。MDA則是脂質過氧化的重要產物，能夠引起蛋白質、核酸等大分子的交聯，其含量能直接反映氧化損傷的程度[7]。本試驗發(fā)現試驗性結腸炎小鼠血清內SOD活力降低、MDA含量升高，而CSD可以抑制該現象的出現，表明試驗性結腸炎造成了小鼠全身性的氧化應激，但CSD可顯著增強小鼠機體的抗氧化能力。文獻報道顯示，薏苡仁作為一種常見谷物，含有豐富的不飽和脂肪酸[9]。而不飽和脂肪酸中的雙鍵具有強大的還原性，可還原組織中的ROS以達到抗氧化的目的[10]。同時，薏苡仁內含有的薏苡素、薏苡仁酯也已被證實具有顯著的抗氧化能力[11]。綜上所述，CSD對試驗性結腸炎小鼠具有保護作用，該作用與CSD的抗氧化能力有一定關系。

免疫反應本質上是機體清除異物，修復自身組織的過程，對機體是有益的。當免疫反應失調時會導致組織過度損傷。因此，如何利用藥物保證機體免疫反應處于正常有序的狀態(tài)是治療的關鍵之一[12]。臨床研究表明，非特異性結腸炎的發(fā)病與腸道免疫紊亂尤其是T淋巴細胞亞群分布變化有密切聯系[13]。在慢性結腸炎病例中，患者結腸組織內CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的表達量相比正常人均出現下降[14]。作為一類可以同時調控先天性免疫和獲得性免疫的細胞，組織內成熟的T淋巴細胞含量降低提示組織出現免疫功能障礙，進而破壞組織穩(wěn)態(tài)并造成炎癥的發(fā)生[14]。因此本試驗使用流式細胞術分析小鼠結腸組織內T淋巴細胞亞群分布，結果顯示，DSS組小鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞表達量與CON組無顯著性差異，但結腸組織病理學檢查發(fā)現，DSS組小鼠結腸黏膜有大量淋巴細胞浸潤。分析其原因，可能是DSS組小鼠在造模過程中雖然出現炎性反應引發(fā)了淋巴細胞募集過程，但組織內的T淋巴細胞并未被激活分化并發(fā)揮作用。但在本試驗中，LCSD組和HCSD組小鼠結腸組織內CD4+T淋巴細胞含量顯著上升，證明CSD可促進T淋巴細胞成熟，從而增強小鼠結腸免疫功能。在炎癥反應過程中，由于炎性因子的分泌以及組織固有免疫細胞的介導，T淋巴細胞被募集并激活分化，從而調控機體免疫反應并抵抗外界病原入侵[14]。然而在本試驗中DSS組小鼠在造模過程中T淋巴細胞并未分化，暗示DSS組小鼠可能存在免疫抑制過程，本課題組將進一步探索其中的機理。

在組織炎性反應過程中，樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞是具有重要作用的固有免疫細胞，其數量可以直接反映固有免疫力的強弱[15]。樹突狀細胞是常見的抗原呈遞細胞，其對T淋巴細胞具有顯著的激活作用。在本試驗中，DSS組小鼠結腸組織內成熟的T淋巴細胞含量降低可能與樹突狀細胞比例顯著下降有關，同時也證實DSS組小鼠結腸組織內存在免疫抑制過程。而CSD維持了樹突狀細胞含量，從而保證了T淋巴細胞激活。巨噬細胞具有強大的分泌作用，近期研究證實，巨噬細胞除常規(guī)促炎作用外，也具有強大的抑炎作用，可以顯著降低組織甚至機體的氧化水平[16]。另外，巨噬細胞的吞噬作用也可以協助組織清除病原，從而恢復組織穩(wěn)態(tài)。由此可以推測，DSS組小鼠結腸組織內巨噬細胞含量顯著降低，從而不能很好的清除抗原、恢復穩(wěn)態(tài)，而持續(xù)存在的病原可能是刺激結腸炎癥進一步加重并導致全身性氧化應激的關鍵。但是CSD可維持小鼠正常巨噬細胞功能，從而保證免疫系統(tǒng)的正常工作，并發(fā)揮保護作用。

綜上所述，本試驗結果表明薏苡仁水提液可以緩解小鼠試驗性結腸炎癥狀，該作用可能與其調節(jié)T淋巴細胞分布、維持固有免疫細胞數量、增強機體抗氧化作用有關。