UFLC-MS/MS法同時測定梔子中5種有效成分的含量

崔 悅，張葆祺，李樂樂，林曉影，馮 波，關 皎，朱鶴云

(吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013)

梔子為茜草科植物，其主要藥物部位是干燥成熟果實，能夠涼血解毒[1]。據文獻報道，梔子具有多種藥理活性，如：抗氧化、抗炎、降壓、保肝、降血糖、抗動脈粥樣硬化、神經保護、抗抑郁、抗腫瘤等[2-7]。梔子中的化學成分眾多，主要包括環烯醚萜苷類、有機酸類、木脂素類、單萜苷類、三萜類等[8-11]。環烯醚萜苷類為梔子的主要活性成分，本試驗選擇的4個測定指標(京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯和京尼平苷酸)屬于環烯醚萜苷類，綠原酸屬于有機酸類。研究表明，京尼平苷能夠治療非酒精性脂肪性肝病[12]、保護老年大鼠軟骨細胞[13]。京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷具有抗心力衰竭[14]、減少黑色素形成和減輕細胞毒性[15]等作用。京尼平苷酸具有良好的抗炎作用[16]。去乙酰車葉草苷酸甲酯具有較好的鎮痛作用[17]。綠原酸是一種天然多酚，可以通過調節腸道健康進而降低仔豬腹瀉率[18]，此外，還具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[19]。

目前，梔子中有效成分的含量測定方法多采用高效液相色譜法[20-22]，其測定成分相對較少且靈敏度低、分析時間較長。本試驗采用的超快速液相色譜-質譜聯用(UFLC-MS/MS)技術是將超快速液相色譜和質譜有機結合的一項新型聯用技術，同時具備優越的色譜分離能力和質譜檢測能力。與高效液相色譜相比，本試驗采用的超快速液相色譜分離速度更快、靈敏度更高、分離度更好，可大大縮短分析時間，提高分離效果，節省溶劑用量，降低分析成本；另外，本試驗所采用的質譜為四極桿線性離子阱質譜儀，具有良好的定性、定量能力，能夠實現對微量分析物的精準定量[20-22]。本試驗建立了梔子中5種有效成分的定量分析方法，并測定了其在梔子藥材中的含量，可為梔子在獸醫獸藥領域的研究與開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 超高快速液相色譜儀(型號：Prominence UFLC，日本島津公司。儀器配置包括：自動進樣器，型號：Prominence SIL-20AHT；二元高壓泵，型號：LC-20AD；柱溫箱，型號：CTO-20A；紫外檢測器，型號：SPD-20A；色譜工作站，型號：LC solution)，三重四極桿質譜儀(型號：3200 QTRAP，美國AB Sciex公司)，微型高速萬能試樣粉碎機(型號：FW80，天津泰斯特公司)，十萬分之一電子天平(型號：CPA 225D，德國Sartorius公司)，數控聲波清洗器(型號：KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 主要試劑 本試驗所使用的對照品包括京尼平苷(批號：19101705)、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷(批號：16120502)、去乙酰車葉草苷酸甲酯(批號：17101701)、京尼平苷酸(批號：19101604)、綠原酸(批號：20121117)，均購自成都普菲德公司，純度均大于98%；乙腈(LC-MS級)，購自美國Fisher公司；甲酸(LC-MS級)，購自國藥集團化學試劑有限公司；水為屈臣氏純凈水；梔子藥材(產地：江西省)，購自吉林市吉林大藥房，經鑒定為梔子道地藥材。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；洗脫方式：梯度洗脫(0～7.0 min,10%～25% B)；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；平衡時間：5 min；進樣體積：5 μL。

1.3.2 質譜條件 采用電噴霧離子(Electrospray ion,ESI)源，負離子和多反應監測(Multiple response monitoring,MRM)模式，源噴霧電壓-4 500 V，霧化氣、輔助氣和氣簾氣壓力分別為50、50 psi 和20 psi。京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的MRM參數見表1。

表1 京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的MRM參數

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品溶液 取京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸對照品適量，精密稱定，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成質量濃度分別為1.0、0.2、0.1、0.1 mg/mL和0.1 mg/mL的儲備液。

1.4.2 供試品溶液 稱得梔子粉末0.5 g于50 mL錐形瓶中，加甲醇-水(50∶50，v/v)溶液25 mL，超聲30 min，放冷，濾過。精密量取續濾液0.5 mL，經 0.22 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.5 方法學考察

1.5.1 線性關系及檢測限、定量限 分別精密量取“1.4.1”項下的各對照品儲備液適量，置于5 mL容量瓶中，加甲醇-水(50∶50，v/v)溶液稀釋至刻度，搖勻，得到京尼平苷濃度分別為 5、10、20、50、100 μg/mL和200 μg/mL，京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷濃度分別為 1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg/mL和40.0 μg/mL，去乙酰車葉草苷酸甲酯濃度分別為 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL，京尼平苷酸的濃度為 0.1、0.2、0.4、1.0、2.0 μg/mL和4.0 μg/mL，綠原酸濃度分別為 0.1、0.2、0.4、1.0、2.0 μg/mL和4.0 μg/mL的系列混合對照品溶液。以對照品的濃度為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，并計算各成分的回歸方程和相關系數。將京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸對照品稀釋后進樣，考察其檢測限(信噪比S/N=3)和定量限(信噪比S/N=10)。

1.5.2 精密度試驗 取混合對照品溶液200 μL，各成分濃度為京尼平苷50 μg/mL，京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷10.0 μg/mL，去乙酰車葉草苷酸甲酯5.0 μg/mL，京尼平苷酸1.0 μg/mL，綠原酸1.0 μg/mL。連續進樣6 次，并計算各待測成分峰面積的相對標準偏差(Relative standard deviation,RSD)。

1.5.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液200 μL，分別于0、2、4、8、12 h和24 h，按“1.3”項中色譜和質譜條件進樣分析，計算各待測成分峰面積的RSD。

1.5.4 重復性試驗 取同一批次梔子樣品，共6 份，按“1.4.2”項方法制備供試品溶液，按“1.3”項中色譜和質譜條件進樣分析，計算各待測成分峰面積的RSD和含量。

1.5.5 加樣回收率試驗 取同一批次已知含量的梔子樣品9份，每份0.25 g，精密稱定，加入對照品京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的量相當于梔子樣品中各對照品含量的80%、100%和120%，各3份。按“1.4.2”項中操作方法，制備供試品溶液并進樣分析，計算各待測成分的回收率和RSD。

1.6 樣品含量測定 取6批梔子樣品，按“1.4.2”項方法制備供試品溶液，按“1.3”項中色譜和質譜條件進樣分析，測定峰面積，計算梔子中各成分的含量。

2 結果

2.1 質譜與色譜圖 京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的產物離子掃描質譜圖見圖1，混合對照品和梔子樣品的MRM色譜圖見圖2。

圖1 京尼平苷(A)、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷(B)、去乙酰車葉草苷酸甲酯(C)、京尼平苷酸(D)和綠原酸(E)的產物離子掃描質譜圖

圖2 混合對照品(A)和梔子樣品(B)的MRM色譜圖

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系及檢測限、定量限 5種有效成分的線性回歸方程見表2。京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸分別在5～200 μg/mL、1.0～40.0 μg/mL、0.5～20.0 μg/mL、0.1～4.0 μg/mL和 0.1～4.0 μg/mL濃度范圍內具有良好的線性關系。京尼平苷的檢測限和定量限分別為20 ng/mL和67 ng/mL，京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的檢測限和定量限分別為10 ng/mL和33 ng/mL，去乙酰車葉草苷酸甲酯的檢測限和定量限分別為10 ng/mL和33 ng/mL，京尼平苷酸的檢測限和定量限分別為5 ng/mL和17 ng/mL，綠原酸的檢測限和定量限分別為3 ng/mL和10 ng/mL。

表2 京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的線性回歸方程

2.2.2 精密度試驗 各待測成分峰面積的RSD值：京尼平苷為1.1%、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷為2.7%、去乙酰車葉草苷酸甲酯為1.6%、京尼平苷酸為2.2%、綠原酸為1.7%，說明儀器精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗 各待測成分峰面積的RSD值：京尼平苷為0.9%、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷為1.5%、去乙酰車葉草苷酸甲酯為2.3%、京尼平苷酸為2.6%、綠原酸為2.3%，表明24 h內供試品溶液具有良好的穩定性。

2.2.4 重復性試驗 各待測成分含量平均值和峰面積的RSD值：京尼平苷為5.04%(RSD=1.8%)、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷為0.839%(RSD=1.7%)、去乙酰車葉草苷酸甲酯為0.044 7%(RSD=2.6%)、京尼平苷酸為0.009 91%(RSD=2.4%)、綠原酸為0.024 4%(RSD=2.0%)，表明該方法重復性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 各待測成分的回收率和RSD結果見表3。

表3 京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的回收率

2.3 樣品含量測定 結果見表4。

表4 6批梔子樣品中京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的含量

3 討論

3.1 色譜和質譜條件的優化 本試驗采用反相高效色譜系統對梔子中的5種有效成分同時進行含量測定，在反相高效色譜中常用的有機相為甲醇和乙腈，故試驗中比較了這2種溶劑作為有機相時的分離效果。采用水-甲醇或水-乙腈作為流動相時，分離效果不佳，色譜峰較寬且有一定程度拖尾。本試驗考察了0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)和 0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)作為流動相的分離效果，0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)作為流動相具有更好的分離效果。分離復雜混合物時，采用梯度洗脫的方式能夠獲得較好的的分離效果，并能夠縮短分析時間。通過不斷反復調整洗脫程序發現過短的分析時間無法成功分離京尼平苷，最終確定的梯度洗脫條件為：0～7.0 min，10%～25% 乙腈，分析時間僅為7 min。

5種待測物均采用電噴霧離子源(ESI)進行分析，負離子模式下的響應高于正離子，因此采用負離子模式進行檢測。京尼平苷主要形成m/z433.1的[M+HCOO]-加合離子，京尼平1-β-D龍膽雙糖苷主要形成m/z595.0的[M+HCOO]-加合離子，去乙酰車葉草苷酸甲酯主要形成m/z449.1的[M+HCOO]-加合離子，京尼平苷酸主要形成m/z373.1的[M-H]-加合離子，綠原酸主要形成m/z353.1的[M-H]-加合離子，以上離子靈敏度高、信號較穩定。

碰撞能(Collision,energy,CE)影響定量結果，故需對CE進行優化。CE較低，在 10～30 eV范圍內時，碎片離子少且穩定；CE 較高，在30～50 eV范圍內時，母離子信號響應較差，形成的碎片離子很多。最終確定京尼平苷、京尼平1-β-D龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的CE值分別為-23、-30、-24、-30 eV和-28 eV，在此碰撞能下獲得的質譜響應良好且穩定。

3.2 提取溶劑的選擇 考察不同提取溶劑(純水、100%乙醇溶液，100%甲醇溶液和50%甲醇溶液)的提取效果，結果發現：采用50%甲醇溶液提取效率最高，此時京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的提取率分別為5.16%、0.799%、0.041 5%、0.008 46%和0.024 9%，最終確定50%甲醇溶液為提取溶劑。

3.3 各待測物含量比較 本試驗測定6批梔子中上述5種有效成分的含量，結果表明，6批梔子的含量均符合《中國藥典》2020年版的規定(含梔子苷不少于1.8%，京尼平苷又名梔子苷)。梔子藥材中上述5種活性成分的含量由高到低依次為：京尼平苷>京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷>去乙酰車葉草苷酸甲酯>綠原酸>京尼平苷酸。含量最高的京尼平苷是梔子中重要的活性成分，具有抗炎、抗氧化等作用，其在梔子中含量豐富，藥理作用強，適合大量提取，可用于對牲畜、家禽及寵物的日常疾病預防與治療[4,23]。本試驗可為相關獸藥的開發提供一定質量標準參考。

本試驗建立了一種UFLC-MS/MS方法以同時測定梔子中5種有效成分的含量，該方法具有分析速度快、分離效果好、靈敏度高等優點。本試驗建立的方法可為中藥梔子在獸藥領域的應用提供質量標準參考，有助于擴大中藥等天然藥物在獸藥領域的應用范圍，為獸藥的開發提供新思路。