犢牛腹瀉病原學檢測及體外藥物敏感性試驗

趙紅霞，呂向聰，宋 晨，郭文瑞，郭 宇，王建龍，周偉光,樊宏亮

(1.內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010010；2.內蒙古動物疫病預防控制中心，內蒙古 呼和浩特 010010；3.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010010)

我國犢牛腹瀉發病率遠遠高于發達國家[1]，尤其在我國氣候寒冷、干燥的北方地區。目前臨床中大腸桿菌感染的疾病主要通過抗菌藥物進行治療[2]，但長期使用易產生耐藥性，使其治療效果下降或無效。為了提高犢牛腹瀉的治愈率，本試驗對內蒙古呼和浩特周邊地區犢牛場腹瀉犢牛的腹瀉病料進行病原學檢測，并對其中的主要病原菌進行體外藥物敏感性測定，旨在篩選出對其敏感的抗菌藥物，從而為有效防治犢牛腹瀉提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2018年10月—2019年6月,在內蒙古呼和浩特周邊地區4個犢牛養殖場選取精神萎靡、食欲不振或體溫升高，排淡黃粥樣或白色水樣糞便，或糞便帶有泡沫、腥臭味、腐臭味的腹瀉犢牛，共采樣50份。

1.2 主要試劑 普通瓊脂培養基、營養肉湯培養基、麥康凱瓊脂培養基(MK)、伊紅美藍瓊脂培養基(EMB)，均購自青島高科園海博生物技術有限公司；腸桿菌生化鑒定管以及四環素(30 μg/片)、多西環素(30 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、恩諾沙星(5 μg/片)、氨芐西林(10 μg/片)、頭孢喹肟(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、多黏菌素B(30 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)共10種藥敏片，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；病毒基因DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自洪陽生物技術有限公司。

1.3 主要試驗儀器 智能生化培養箱，購自寧波江南儀器廠；電子天平，購自德國賽多科斯股份公司；超凈工作臺，購自上海躍進醫療器械廠；電泳儀，購自北京市六一儀器廠。

1.4 病毒的檢測 對常引起犢牛腹瀉的4種病毒[牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛冠狀病毒(BCoV)和牛細小病毒(BPV)]進行檢測,所用引物根據參考文獻[3-4]進行設計,由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。病毒采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和PCR進行檢測。取被檢糞樣1 g，加生理鹽水4 mL混勻;反復凍融2次，8 000 r/min離心10 min，取上清，用病毒 DNA/RNA 提取試劑盒提取病毒核酸樣品，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。PCR反應體系(20 μL)：模板3 μL，上、下游引物各 1 μL，PremixTaq10 μL,ddH2O 5 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,共30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR反應產物用15 g/L瓊脂糖平板凝膠電泳進行檢測。

表1 病毒檢測引物序列

1.5 細菌的分離培養與純化 在超凈工作臺下，將病料置于滅菌生理鹽水中混勻，接種于已配制好的無菌營養肉湯中，37 ℃培養24～36 h進行增菌。待菌液呈渾濁時，接種到伊紅美藍培養基中，37 ℃培養18 h，挑取有紫黑色并帶有綠色金屬光澤的單菌落接種于麥康凱培養基上，37 ℃培養18～24 h，得到單一的鮮紅菌落，進行革蘭染色鏡檢和生化鑒定。

1.6 分離菌的生化鑒定 用接種針挑取已分離純化的單一菌落，進行三糖鐵、五糖發酵、IMViC試驗[包括靛基質(I)試驗、甲基紅(M)試驗、二乙酰(V)試驗、檸檬酸鹽(C)試驗]、尿素酶試驗進行生化鑒定；能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產酸產氣，不分解蔗糖，三糖鐵斜面和底部均為黃色，且有氣體產生，不產H2S，IMViC試驗結果為“++--”的細菌判定為大腸桿菌。

1.7 分離菌的PCR鑒定 將生化鑒定疑似大腸桿菌的菌樣，以按照TaKaRa細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取的DNA為模板，使用16S rDNA通用引物進行PCR擴增。PCR引物序列[2]見表2。PCR反應體系(25 μL):模板1.0 μL，引物27F、1492R各0.5 μL,PremixTaq12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共25個循環;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，PCR陽性產物送至北京六合華大基因科技有限公司測序并將結果上傳到NCBI中進行序列比對，確定菌種。

表2 大腸桿菌檢測引物序列

1.8 藥敏試驗 采用K-B法進行藥敏試驗，選擇臨床常用的10種藥敏紙片，參考美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)(2009年)進行藥敏結果的判讀，抑菌圈直徑<10 mm判定為耐藥；抑菌圈直徑>15 mm判定為敏感；10 mm≤抑菌圈直徑≤15 mm判定為中介。

2 結果

2.1 病毒的檢測 病毒病原檢測結果如表3所示，50份糞樣中BVDV、BRV以及BVDV和BRV混合感染檢出率分別是34%(17/50)、44%(22/50)、16%(8/50)，而BCoV、BPV均為陰性。

表3 犢牛腹瀉糞樣中病原檢測結果

2.2 分離菌培養特性 分離菌株在普通瓊脂培養基上生長良好，直徑2～3 mm，邊緣整齊、灰白色，呈半透明的菌落。在麥康凱瓊脂培養基上呈粉紅色、圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊的菌落。在伊紅美藍瓊脂培養基上形成紫黑色菌落(圖1)，并帶有綠色金屬光澤。革蘭染色鏡檢(圖2)為陰性、兩端鈍圓的小桿菌。

圖1 分離菌在伊紅美蘭平板上的菌落形態

圖2 分離菌革蘭染色鏡檢形態(100×)

2.3 分離菌生化特性 將分離到的39株疑似大腸桿菌菌株進行生化鑒定，結果見表4。根據乳糖發酵試驗和IMViC試驗結果可以得出，分離到的39株疑似大腸桿菌均符合大腸桿菌的生化特性。

表4 疑似大腸桿菌的生化鑒定

2.4 分離菌PCR鑒定 將39株分離菌16S rDNA基因PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示，擴增條帶大小與標準菌株ATCC 25922條帶大小相符(1 500 bp 左右)。

圖3 大腸桿菌16S rDNA的PCR擴增

2.5 藥敏試驗 39株大腸桿菌體外藥物敏感性試驗結果如表5和圖4所示，大腸桿菌具有多重耐藥性，并且對四環素、多西環素、慶大霉素、鏈霉素的耐藥率最高，均高于90.0%。其次是氟苯尼考(84.6%)、氧氟沙星(79.5%)、氨芐西林(76.9%)、恩諾沙星(74.4%)，但對頭孢喹肟和多黏菌素B具有較強的敏感性，敏感率達60.0%以上。

圖4 犢牛腹瀉大腸桿菌多重耐藥水平

表5 39株分離菌的藥敏試驗

3 討論

本試驗通過對內蒙古呼和浩特周邊地區部分規模牛場進行調研，發現犢牛腹瀉普遍存在，且嚴重危害飼養場的經濟發展。本試驗對50份犢牛腹瀉糞便樣品進行BVDV、BRV檢測，結果顯示，BVDV 檢出率(34%)略高于2015年Deng等[5]報道的全國奶牛陽性率(32.06%)和2019年孫力等[6]報道的新疆地區陽性率(24.6%)，但低于2019年宋維彪等[7]報道的青海省牦牛陽性率(51.59%)。我國不同地區BRV的感染率和流行率差異較大，平均流行率介于30%～40%，而歐美等國感染率高達90%以上[8]。本試驗BRV的檢出率為44%，BVDV和BRV混合感染率為16%，說明內蒙古呼和浩特周邊地區存在著嚴重的病毒性感染，建議加強疫病的防控，同時在保障安全有效的前提下對持續感染(Persistent infection，PI)牛開展凈化淘汰。

有研究報道[9-10]顯示，大腸桿菌感染也是引起犢牛腹瀉的主要原因之一，臨床上根據大腸桿菌引起的犢牛腹瀉的病理特征和病變情況將其分為敗血型、腸毒血型以及腸炎型，病情嚴重時患牛幾天內就可能死亡。本試驗對50份樣品進行細菌分離鑒定，通過生化鑒定和PCR鑒定共分離出39株大腸桿菌，分離率為78%，與楊斯琴等[11]報道的內蒙古呼和浩特地區牛源致病性大腸桿菌的檢出率(79%)基本一致。斯木古德等[12]報道的荷斯坦牛新鮮糞便大腸桿菌檢出率為40.12%，與本試驗大腸桿菌檢出率相比較低。本試驗結果和其他學者報道的研究結果均表明，大腸桿菌的流行存在著明顯的地域差異性。應通過加強飼養管理、科學規范消毒環境和用具，預防犢牛場大腸桿菌病的暴發。

本試驗選取臨床常用的10種抗菌藥進行體外藥物敏感性試驗，結果顯示，39株大腸桿菌對10種抗菌藥的耐藥程度不容樂觀。39株分離菌對四環素、多西環素、慶大霉素、鏈霉素、氟苯尼考、氨芐西林、恩諾沙星和氧氟沙星7種抗菌藥物均產生耐藥性，并且耐藥率均高于70%，不推薦臨床中繼續使用這些抗菌藥。2015年，崔冰冰[13]對中國北方部分規模化奶牛場的34株犢牛腹瀉大腸桿菌對22種常用抗生素的耐藥情況進行了分析，發現對10種以上抗菌藥耐藥的菌株有24株，占比達70.59%。2016年，劉少昆[14]從北京、天津牛場腹瀉犢牛樣本中共分離到32株強致病性大腸桿菌，并對其多重耐藥性進行分析，發現天津地區犢牛大腸桿菌致病株全部為多重耐藥菌株，最多對16種抗菌藥耐藥，其中對14種抗菌藥耐藥的菌株占比最大；北京地區中僅1株只耐1種藥物，對13種抗菌藥耐藥菌株占比最大。本試驗分離菌株對多黏菌素B和頭孢喹肟的敏感性達60%以上，可在臨床中繼續使用，但應規范使用。上述數據表明，犢牛腹瀉大腸桿菌多重耐藥普遍存在，細菌多重耐藥性的產生不僅給動物疾病的防治帶來了困難，同時還給食品安全以及人類健康造成嚴重的威脅。因此，應尋找新型安全天然添加劑作為抗菌藥物的替代品，如黃芪多糖、天蠶素等中草藥，既可以增強動物機體的免疫力，又有抗菌功效，且不存在藥物殘留問題[15-17]，同時要加強平時的飼養管理，提高機體免疫力，減少疾病的發生。