山羊溶血性曼氏桿菌與多殺性巴氏桿菌混合感染診治

高山雁，胡 園，羅 勤，楊世忠，楊發龍

（1.四川省會東縣農業農村局，四川 會東 615200；2.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041；3.四川省珙縣農業農村局，四川 珙縣 644500；4.四川省涼山州畜牧獸醫科學研究所，四川 西昌 615000）

1 發病情況

某山羊養殖場存欄黑山羊500 只左右，羊以放牧為主，補飼為輔。因放牧時天氣乍雨乍晴，陸續有周歲以下的山羊出現精神萎靡，眼角有膿性分泌物，咳嗽，流清亮鼻液的臨床癥狀。羊發病早期用替米考星治療，效果較好，但病情隨后出現反復，后期治療效果較差。

2 實驗室診斷

2.1 病原PCR檢測 無菌采集病山羊的鼻腔拭子送檢，用酚-氯仿法提取樣本總DNA，用于綿羊肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌、絲狀支原體以及溶血性曼氏桿菌等常見的引起山羊呼吸道疾病病原的PCR 檢測。本次PCR 擴增鑒定引物參照文獻，引物信息見表1。

表1 各引物信息

病原的PCR 擴增鑒定采用25 μL 反應體系，即Premix Taq 酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，去離子水8.5 μL。PCR 反應條件為：95 ℃5 min；94 ℃30 s，54～60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個循環；72 ℃10 min 終止反應。PCR反應結束后，采用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，于凝膠成像系統觀察結果。結果顯示溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌擴增條帶與目的條帶大小一致，分別為207 bp和460 bp，其余擴增結果均為陰性。

2.2 細菌分離鑒定

2.2.1 細菌分離培養 無菌采集40 只病山羊的鼻腔拭子，劃線接種于20 個綿羊血瓊脂平板上，將血平板置于37 ℃恒溫培養箱培養18 h。結果平板上長出大小不一且有溶血環的光滑、濕潤、露珠樣的菌落，從每個平板上挑取疑似的單個菌落接種到含5%新生牛血清的TSA 固體培養基上進行純化，對純化后的單個菌落進行染色、鏡檢，結果見革蘭氏陰性短桿菌。無菌挑取單個菌落接于新的TSB液體培養基中，置于37 ℃的空氣浴水平搖床（160 r/min）進行增菌，培養8 h。

2.2.2 菌落PCR 鑒定 取增菌菌液，用酚-氯仿法提取細菌總DNA，以溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌特異性引物進行PCR擴增，結果顯示擴增片段長度與預期片段長度相符。將鑒定后的菌液外送測序，采用DNAStar 軟件對測序結果進行序列分析，通過網絡數據庫NCBI進行比對，結果顯示所獲得的序列與NCBI 已公布的溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌序列的相似性為100%，表明所分離到的菌株為溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌。

3 診斷

綜合流行病學、臨床癥狀以及實驗室檢查結果，確診山羊的呼吸道疾病是由溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌混合感染引起的。

4 防治

4.1 疫苗免疫

4.1.1 疫苗制備 復蘇細菌：蘸取甘油保種菌液（純化得到的菌株）進行平板劃線，培養18 h；增菌：將培養基上的單個菌落擴增到含2 mL培養液的無菌離心管中；擴大培養：根據所需菌液量擴大培養細菌；甲醛滅活：按菌液容量加入0.2%的甲醛，滅活8 h。取100 μL增菌液進行平板涂布，觀察是否滅活完全；乳化：量取等量的菌液與佐劑加入勻漿機中，勻漿15 min，然后倒入燒杯中，采用小風扇繼續乳化30 min至乳白色，乳化完成后，制備液裝入無菌容器內常溫放置過夜，疫苗即制作完成。

4.1.2 疫苗接種 經無菌檢驗后的疫苗低溫冷藏保存并運至接種場，先接種4～5 只山羊，其無異常反應后，再開展全群免疫，每只羊于頸部皮下注射3～5 mL。

4.2 藥物治療

4.2.1 藥敏試驗 采用紙片擴散法對分離純化的溶血性曼氏桿菌菌株和多殺性巴氏桿菌菌株進行藥敏試驗。試驗結果判定按照美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）指導標準，以“敏感、中介、耐藥”記錄結果，其結果見表2、表3。

表2 分離溶血性曼氏桿菌菌株藥敏試驗結果

表3 分離多殺性巴氏桿菌菌株藥敏試驗結果

4.2.2 藥物治療 根據藥敏試驗結果，選用氟苯尼考對病羊進行治療（劑量和用法遵照說明書使用），同時加強羊的營養，注意通風和消毒。

5 小結

溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌是革蘭氏陰性菌，是山羊、綿羊、牛等反芻動物呼吸道的常在菌，當遇環境驟變、運輸不當等不良因素時，可引起發病。PCR 檢測技術具有快速、靈敏、準確的優點，能夠對這兩種病菌感染作出確定診斷。

規?；s化養殖中，除關注羊群的疾病防控外，還要注意加強飼養管理，特別在環境突然改變的情況下，要盡量避免羊只因抵抗力減弱而發病。