血清學抗中性粒細胞胞漿抗體在炎癥性腸病中的表達及其診斷價值

鐘選芳 周 瀟 張麗科

1.廣東省惠州市第一人民醫院消化內科，廣東惠州 516000；2.廣東省惠州市第一人民醫院檢驗科，廣東惠州 516000

炎癥性腸病 （inflammatory bowel disease，IBD）是一組病因不明的主要累及胃腸道的慢性炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn's disease，CD），近年來發病率呈上升趨勢，但診斷和鑒別診斷較難，需結合臨床、內鏡、影像、病理等綜合分析[1]。文獻報道血清學標志物可幫助診斷和鑒別診斷IBD[2-3]。近年來國內外對抗中性粒細胞胞漿抗體 （anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相關抗體與IBD 的關系報道不同中心的研究結論不甚一致，各抗體在IBD 中的臨床意義尚不明確，與臨床表型的關系報道尚有爭議[4-7]。本研究探討單獨和聯合檢測血清核周型ANCA（perinuclear-ANCA，p-ANCA）、胞漿型ANCA（cytoplasmic-ANCA，c-ANCA）、蛋白酶3-ANCA（proteinase 3-ANCA，PR3-ANCA）、髓過氧化物酶-ANCA（myeloperoxidase-ANCA，MPO-ANCA）4種ANCA 相關抗體在IBD 診斷、鑒別診斷的臨床意義，探討抗體水平與IBD 疾病表型和臨床特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月至2021年2月在惠州市第一人民醫院收治的123 例IBD 患者作為研究對象，按照疾病類型分為UC 組（78 例）與CD 組（45 例），選取同期收治的非IBD 腸道疾病患者56 例作為疾病對照組（其中腸結核8 例，腸白塞病2 例，腸易激綜合征7例，嗜酸性胃腸炎1 例，缺血性腸病13 例，非特異性腸炎19 例，孤立性直腸潰瘍2 例，過敏性紫癜4 例），選取同期在健康體檢中心體檢的30 名健康體檢者作為正常對照組。UC 組中，男46 例，女32 例；年齡18～58歲，平均（46.1±13.7）歲；CD 組中，男31 例，女14 例；年齡16～49 歲，平均（33.9±13.4）歲；疾病對照組中，男32例，女24 例；年齡14～62 歲，平均（45.9±15.7）歲。正常對照組中，男19 名，女11 名；年齡18～64 歲，平均（42.1±13.9）歲。四組研究對象的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：①UC 組和CD 組患者均符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2012，廣州）》的相關診斷標準[8]；②UC 組與CD 組患者均為初次診斷，并且在未進行治療之前納入本研究，本研究中的4 種抗體檢測均在患者治療之前進行；③患者精神狀態良好，能夠配合研究中的各項檢查的進行。排除標準：①未定型結腸炎；②伴有自身免疫系統疾病、遺傳性疾病的患者；③確診各種惡性腫瘤包括實體瘤與血液系統腫瘤的患者；④患者正在進行免疫調節，免疫抑制治療；⑤患者伴有嚴重的血液系統疾病，凝血功能障礙等；⑥伴有精神疾病，無法配合研究進行的患者。所有患者均簽署知情同意書；本研究嚴格遵守倫理學標準要求，并通過惠州市第一人民醫院醫學倫理委員會審核批準（批號2019044）。

1.2 抗體檢測

所有研究對象均采用間接免疫熒光法（IIF 法）檢測血清p-ANCA、c-ANCA 的表達水平，采用酶聯免疫法（ELISA 法）檢測血清PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表達水平。試劑由美國宙斯（Zeus）公司提供，操作步驟如下。①加樣：分別取稀釋過的陰性對照、陽性對照、校正品和血清樣品100 μl 加入到對應的反應孔中，取100 μl 樣本稀釋液加入到對應孔中作為試劑空白對照；②溫育：溫度為室溫（20～25℃），時間（25±5）min；③洗板5 次；④加入酶聯物：每孔中加入酶聯物100 μl；⑤溫育：溫度為室溫（20～25℃），時間（25±5）min；⑥洗板5 次；⑦加入顯色液（TMB）：每孔中加入TMB 100 μl；⑧溫育：溫度為室溫（20～25℃），時間10～15 min；⑨加入終止液：每孔加入終止液50 μl 以終止反應；⑩讀數：在加入終止液30 min 內，將微孔板置于450 nm波長下讀取每個孔的光密度值，以空白試劑作對照。

1.3 觀察指標及評價標準

①四組患者的血清p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的檢測陽性率以及4 種抗體聯合檢測（即任一抗體陽性即為陽性）的檢測陽性率；②p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 單獨使用以及4 種抗體聯合使用的診斷敏感度、特異度、準確度、陽性預測值，陰性預測值。敏感度=真陽性/（真陽性＋假陰性）×100%；特異度=真陰性/（假陽性＋真陰性）×100%；準確度=（真陽性＋真陰性）/總例數×100%；陽性預測值=真陽性/（真陽性＋假陽性）×100%，陰性預測值=真陰性/（真陰性＋假陰性）×100%；③4 種血清學抗體對UC 和CD 鑒別診斷的效能；④不同臨床特征的UC 患者的p-ANCA 表達情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義；計數資料采用率表示，組間整體比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用Bonferroni 方法校正，檢驗水準α=原α 水平/比較次數，即0.05/6=0.008。

2 結果

2.1 各組患者血清p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表達情況

四土組患者的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 及4 種抗體聯合檢測的陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。UC 組患者的p-ANCA 高于CD 組、疾病對照組、正常對照組，c-ANCA、PR3-ANCA、聯合檢測高于疾病對照組、正常對照組，MPOANCA 高于疾病對照組，差異有統計學意義（P＜0.008）。CD 組的c-ANCA 及聯合檢測高于疾病對照組、正常對照組，MPO-ANCA 高于疾病對照組，差異有統計學意義（P＜0.008）。其余各指標組間兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.008）（表1）。

表1 各組患者p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表達情況[n（%）]

2.2 血清學抗體診斷IBD 的效能

4 種抗體聯合檢測診斷IBD 的敏感度和準確度最高，分別為66.7%、75.1%；PR3-ANCA 和MPOANCA 的特異度最高，均為95.3%。4 種抗體及聯合檢測的敏感度和準確度比較，差異有統計學意義（P＜0.05），而特異度比較差異無統計學意義（P＞0.05）。P-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的陽性預測值分別為91.2%、89.9%、87.9%、88.9%、88.2%；陰性預測值分別為53.3%、60.0%、46.6%、47.4%、64.7%。

4 種抗體單獨檢測診斷IBD 的特異度均較高（90.1%～95.3%）。提示用于鑒別診斷價值較高，但敏感度均不高，單獨檢測中c-ANCA 的敏感度最高，但也僅為57.7%，獨立作為篩查指標的價值可能有限。4種抗體聯合檢測的敏感度比單獨檢測高，但特異度有所下降，提示聯合檢測抗體比單獨檢測可能更有利于IBD 的篩查和診斷（表2）。

表2 4 種抗體及聯合檢測對IBD 的診斷效能[%（n/N）]

2.3 血清學抗體對UC 和CD 鑒別診斷的效能

表1結果顯示，其他抗體對CD 診斷意義不大，效能較低，且數據量較大，故僅列出診斷價值較高的4 項，見表3。PR3-ANCA 診斷UC 的特異度最高，但敏感度僅為26.9%，p-ANCA 診斷UC 的效能較好，四項聯合檢測能提高診斷UC 的敏感度，但特異度有所下降，c-ANCA 診斷CD 的敏感度和特異度均不高，鑒別診斷效能較低。

表3 4 種抗體在UC 與CD 鑒別診斷中的效能[%（n/N）]

2.4 p-ANCA 與UC 患者臨床特征的關系

選擇診斷效能最好的p-ANCA 進行分析，比較不同臨床特征UC 患者的p-ANCA 檢測結果，結果顯示，p-ANCA 在中重度UC 患者中陽性率高于輕度UC 患者，病變部位在廣泛結腸的患者占比高于其他部位，差異有統計學意義（P＜0.05）（表4）。

表4 不同臨床特征的UC 患者的p-ANCA 表達情況[n（%）]

3 討論

IBD 的病因以及發病機制目前尚未明確，但是通過大量研究表明IBD 的發病與免疫功能失衡有關。免疫抗體多數可以作為血清學檢測指標對疾病診斷起到輔助作用，并且血清學標志物無創，技術要求并不高，檢測簡單方便，可以量化，因此在疾病的檢查診斷以及嚴重程度分層中都獲得了廣泛應用[9]。IBD 無明確的診斷金標準，并且疾病的早期診斷，疾病的嚴重程度分級，疾病治療效果的評估，預后評估，復發評估等都缺乏具有良好臨床診斷價值的量化指標，具有良好敏感度以及特異度的血清學標志物可以滿足IBD的診斷以及評估需求[10]。目前IBD 的血清學標志物眾多，其中自身抗體抗ANCA 研究最為廣泛，但是各種不同分型的ANCA 抗體在IBD 患者中的具體表達情況，以及診斷效能在眾多研究中結論不一[11]。本研究目的是探討單獨和聯合檢測ANCA 相關4 種血清學自身抗體p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 在IBD 診斷、鑒別診斷的臨床意義，探討抗體水平與IBD 臨床特征的關系。本研究結果顯示，UC 組患者的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、4 種抗體聯合檢測的表達陽性率高于疾病對照組以及正常對照組，CD組患者的p-ANCA、c-ANCA、4 種抗體聯合檢測的表達陽性率高于疾病對照組以及正常對照組，UC 組和CD 組患者的MPO-ANCA 的陽性率均高于疾病對照組（P＜0.008），而疾病對照組與正常對照組的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表達情況均無明顯統計學差異（P＞0.008）。與其他腸道疾病患者以及健康正常患者相比，IBD 患者具有明顯的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 表達改變，提示IBD 患者可能存在ANCA 相關的自身免疫抗體表達異常，與何淳等[12]的報道結果相似。

本研究中p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPOANCA 4 種抗體單獨檢測診斷IBD 的特異度均較高（90.1%～95.3%），但敏感度均不高，提示用于鑒別診斷價值較高，但獨立作為篩查指標的價值可能有限，4種抗體聯合檢測的敏感度比單獨檢測高，但特異度有所下降，提示聯合檢測抗體比單獨檢測可能更有利于IBD 的篩查和診斷，與van Schaik 等[13]的研究報道一致，其研究提示聯合血清標志物診斷IBD 的預測值比單一血清標志物高。國內傅蘇娜等[14]的研究也提示聯合多種血清學標志物有助于IBD 的診斷。Smids 等[15]報道血清學標志物可以鑒別診斷UC 和CD，Arias-Loste 等[16]報道PR3-ANCA 在血清學標志物中更普遍，滴度在UC 患者比CD 患者更高，ROC 曲線范圍為0.81，敏感度和特異度分別為52.1%和97.3%，提示PR3-ANCA 可能是一個有助于鑒別診斷IBD 的血清學標志物。本研究中PR3-ANCA 診斷UC 的特異度最高，達82.2%，提示PR3-ANCA 可能有助于鑒別診斷UC 和CD。本研究中UC 患者的p-ANCA 與CD 患者的表達具有明顯差異，并且在UC 與CD 的鑒別診斷中具有較好的敏感度與特異度，具有較好的鑒別診斷效能，可以用于UC 與CD 的鑒別診斷，與文獻報道結果一致。文獻報道UC 患者中p-ANCA 的敏感度和特異度分別是44%和86%，陽性預測值和陰性預測值分別為78%和58%，提示p-ANCA 對于鑒別UC 和CD是一個有利的參數[17]。國內一項meta 分析顯示ANCA診斷UC 的敏感度和特異度分別約51%和92%，最佳敏感度和特異度位置為0.727[18]。

關于血清學抗體與IBD 臨床特征的關系報道也很多，本研究分析了不同臨床特征的UC 患者中p-ANCA 的表達情況發現，p-ANCA 在中重度UC 患者中陽性率高于輕度UC 患者，病變部位在廣泛結腸的患者占比高于其他部位，差異有統計學意義（P＜0.05），表明在不同嚴重程度，不同病變部位的UC 患者中p-ANCA 表達具有明顯差異，提示p-ANCA 的表達與UC 的嚴重程度、病變部位可能相關，p-ANCA 的表達可能有助于評估UC 病情，與Wang 等[10]的報道一致，他們比較了41 例UC 患者、71 例CD 患者、71 例其他胃腸道疾病患者和31 例正常健康對照者，結果發現p-ANCA 在中重度活動性UC 陽性率比輕度活動性UC 高。但我國袁柏思等[19]研究結果表明p-ANCA 與UC 患者的診斷年齡、病變位置、治療方式均無關，總之，ANCA 相關抗體在IBD 的臨床意義值得進一步探討。本研究樣本量較少，觀察指標較少，并且未根據疾病嚴重程度分級進行分組，因此本研究結論也有一定的局限性，未來可以加大樣本量，根據疾病分層對血清學標志物進行進一步的研究。

綜上所述，p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPOANCA 在IBD 中的表達與非IBD 患者具有明顯差異，4 種抗體聯合檢測對IBD 診斷效能更好，p-ANCA 對UC 的病情評估可能具有一定的輔助價值，值得在臨床推廣使用。