HPLC法測(cè)定復(fù)方連翹膏改良制劑中黃芩苷的含量

謝紫燁，孫華燕，王歡歡，白 林，周亞靜，黃曉舞（解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心藥劑科，北京 100853）

復(fù)方連翹膏是我院非標(biāo)制劑，由連翹、黃芩、五味子、五倍子四味中藥組成，臨床用于癤病，效果良好。處方中的連翹清熱解毒、消癰散結(jié)，被譽(yù)為瘡家之圣藥，黃芩清熱解毒，燥濕涼血，五倍子解毒斂瘡，五味子收斂固澀，四藥合用，共同發(fā)揮清熱解毒，收斂濕瘡之效，可用于熱毒所致的癤病，膿腫潰爛者。復(fù)方連翹膏臨床療效雖好，但起效較緩，涂于皮膚，有較強(qiáng)黏膩感。基于患者用藥反饋，本研究在原有配方基礎(chǔ)上，對(duì)現(xiàn)有制劑進(jìn)行工藝改良，針對(duì)潛在藥效成分建立相關(guān)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。黃芩苷是黃芩的主要成分，前期實(shí)驗(yàn)表明黃芩苷在樣品中含量較高。藥理研究表明，黃芩苷具有良好的抑菌、抗炎活性，可減弱癤的主要致病菌金黃色葡萄球菌生物膜的形成，下調(diào)其毒力相關(guān)因子的表達(dá)，防止金黃色葡萄球菌的攻擊[1]，能顯著減少組織中有關(guān)炎性因子表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管形成和成熟，改善組織供血功能與組織結(jié)構(gòu)，減少感染相關(guān)的組織損傷[2-3]。本文以潛在藥效成分黃芩苷為質(zhì)控指標(biāo)，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對(duì)復(fù)方連翹膏改良制劑中黃芩苷的含量進(jìn)行測(cè)定，為其工藝優(yōu)化提供質(zhì)控參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MS205DU電子天平（美國(guó)梅特勒-托利多公司），Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

復(fù)方連翹膏改良制劑（解放軍總醫(yī)院制劑室，批號(hào)：20220128；規(guī)格：20 g）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-202122，純度：94.2%）、黃芩對(duì)照藥材（批號(hào)：120955-201309），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇及乙腈為色譜純，無(wú)水乙醇為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，試劑用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[4]

Agilent Extent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-乙腈（1∶1）為A相，以0.4%磷酸水溶液為B相，A相-B相（35∶65）等度洗脫；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量10 μL；理論塔板數(shù)按黃芩苷色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于量瓶中，加流動(dòng)相適量，制成每1 mL約含25 μg的黃芩苷對(duì)照品溶液，搖勻，采用0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾，備用。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方連翹膏改良制劑約0.25 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加70%乙醇約15 mL，超聲至完全溶解，70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，采用0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾，備用。

2.2.3 黃芩對(duì)照藥材溶液[4]取黃芩對(duì)照藥材約0.5 g，精密稱定，加70%乙醇40 mL，加熱回流3 h，放冷，過(guò)濾，濾液置100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)匆簽V入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，采用0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾，備用。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液 取缺少黃芩藥材的陰性對(duì)照樣品約0.25 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，得陰性樣品溶液。

2.3 專屬性

分別精密吸取空白溶劑、陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液、黃芩對(duì)照藥材溶液、供試品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果顯示，供試品溶液在保留時(shí)間約11 min處有與黃芩苷對(duì)照品溶液及黃芩對(duì)照藥材溶液相同的色譜峰，該峰峰形良好，與其他組分分離度良好，理論塔板數(shù)大于2500，且空白溶劑及陰性樣品在該保留時(shí)間處均無(wú)干擾，表明本方法專屬性良好。

圖1 HPLC圖A – 對(duì)照品溶液，B – 供試品溶液，C – 黃芩對(duì)照藥材溶液，D – 陰性對(duì)照溶液；1 – 黃芩苷Fig 1 HPLC chromatogramA – reference solution, B – sample solution, C – scutellaria baicalensis reference solution, D – negative control solution; 1 – baicalin

2.4 精密度

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄黃芩苷色譜峰峰面積，結(jié)果顯示黃芩苷峰面積的RSD值為0.04%（n = 6），表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性

取同一批次樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄各供試品溶液中黃芩苷的峰面積，并計(jì)算黃芩苷的平均含量及RSD值。結(jié)果顯示，黃芩苷的平均含量為10.30 mg·g-1（RSD = 0.94%，n = 6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 檢測(cè)限及定量限

精密稱取黃芩苷對(duì)照品15.75 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備溶液。精密吸取對(duì)照品溶液，加流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成適宜濃度，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，進(jìn)樣測(cè)定，在信噪比為3.3∶1時(shí)，測(cè)得檢測(cè)限為0.12 μg·mL-1，在信噪比為10∶1時(shí)，測(cè)得定量限為0.38 μg·mL-1。

2.7 線性關(guān)系

精密量取“2.6”項(xiàng)下對(duì)照品貯備溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，分別置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為2.37、4.75、11.87、23.74、47.49、94.98 μg·mL-1的黃芩苷對(duì)照品系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作線性回歸，得出黃芩苷濃度與峰面積的關(guān)系曲線為Y = 38.05 X – 9.98（r = 1.000 0）。結(jié)果表明，黃芩苷在2.37 ～ 94.98 μg·mL-1范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：20220128，含量10.30 mg·g-1）約0.14 g，精密稱定，按照低、中、高三個(gè)水平分別精密加入對(duì)照品溶液1.189 6 mg、1.487 0 mg、1.784 3 mg，每個(gè)水平制備3份，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法得供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果顯示，黃芩苷的平均回收率為97.65%（RSD = 1.25%，n = 9），見(jiàn)表1。表明本方法準(zhǔn)確性良好。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果. n = 9Tab 1 Result of recovery test for baicalin. n = 9

2.9 穩(wěn)定性

將制備好的供試品溶液置于室溫，分別于0、1、2、4、6、8 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖及黃芩苷色譜峰峰面積。結(jié)果顯示，各色譜圖圖譜相似，無(wú)多余色譜峰出現(xiàn)，黃芩苷峰面積的RSD值為0.05%。表明供試品溶液在室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

參照中國(guó)藥典2020年版一部黃芩藥材標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究對(duì)復(fù)方連翹膏改良制劑中黃芩苷的HPLC測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化。前期以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動(dòng)相[4]，選擇Agilent Extent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），黃芩苷與相鄰雜質(zhì)峰未能完全分開(kāi)。調(diào)整流動(dòng)相比例，采用甲醇-0.4%磷酸（50∶50）等度洗脫、降低柱溫[5-6]后均未達(dá)到分離效果，且存在柱壓高的問(wèn)題。換用有機(jī)相為黏度較小的乙腈，采用乙腈-0.4%磷酸水溶液（25∶75）等度洗脫[7]，柱壓明顯降低，黃芩苷與相鄰雜質(zhì)峰分離，但在流動(dòng)相微小變動(dòng)下，黃芩苷與相鄰雜質(zhì)峰相對(duì)出峰順序有變動(dòng)，未能完全分離，說(shuō)明該流動(dòng)相不耐用。故綜合考慮黃芩苷的分離度及色譜柱柱壓，選用混合有機(jī)相（A相）甲醇-乙腈（1∶1），水相（B相）0.4%磷酸水溶液為洗脫溶劑，在A相-B相（35∶65）的條件下等度洗脫，黃芩苷與相鄰雜質(zhì)峰完全分離，色譜柱的柱壓良好。

3.2 系統(tǒng)耐用性的考察

本研究考察了柱溫（30±5 ℃）、流動(dòng)相比例A相-B相（35±5%∶65±5%）及不同色譜柱Agilent Extent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Dikma ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)復(fù)方連翹膏改良制劑中黃芩苷測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，樣品溶液中黃芩苷與相鄰雜質(zhì)峰均能完全分離，理論塔板數(shù)均大于2500，各條件下黃芩苷色譜峰面積基本無(wú)變化（RSD ≤ 2.0%），表明本方法系統(tǒng)耐用性良好。

3.3 樣品前處理方法優(yōu)化

復(fù)方連翹膏是以藥材細(xì)粉入藥，凡士林為基質(zhì)的黃棕色軟膏制劑。本研究在原有配方基礎(chǔ)上，對(duì)四味藥的潛在藥效成分進(jìn)行提取，以相應(yīng)的醇浸出物代替原藥材細(xì)粉入藥，選用水溶性較好的聚乙二醇類物質(zhì)為基質(zhì)，使?jié)撛谒幮С煞挚蓮幕|(zhì)中較快釋放，制劑的黏膩感也明顯降低。

基于復(fù)方連翹膏改良制劑的制備工藝，本研究考察了不同提取溶劑（水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）、提取方法（振搖、超聲20 min、超聲40 min）對(duì)供試品中黃芩苷含量的影響。結(jié)果表明，在不同提取溶劑下供試品溶液的渾濁程度為：水（渾濁）、95%乙醇（渾濁）、50%乙醇（略顯渾濁）、70%乙醇（澄明），含量測(cè)定結(jié)果亦表明，70%乙醇提取物中黃芩苷的含量最高，故采用70%乙醇作為提取溶劑。供試品經(jīng)振搖溶解與超聲20 min或40 min溶解所制得的供試品溶液中黃芩苷的含量無(wú)明顯差別。為了便于提取，本研究采用超聲至完全溶解的提取方式。且在此供試品溶液制備方法下，基質(zhì)溶液澄清透明，在280 nm處無(wú)吸收，不干擾成分測(cè)定。

綜上，本文建立了復(fù)方連翹膏改良制劑中黃芩苷的HPLC測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。后期將針對(duì)藥物清熱解毒、收濕斂瘡的功效，聚焦于抑菌、抗炎的藥理作用，對(duì)復(fù)方連翹膏改良制劑的潛在藥效成分進(jìn)行分析，為其工藝優(yōu)化提供更為全面的質(zhì)控參考。