水泡性口炎病毒通過基質金屬蛋白調控結腸癌SW480細胞增殖、遷移和侵襲

李 戈 姚夢瑋 李玉遷 李 勝 方小涵 魏 洪▲

1.貴州醫科大學基礎醫學院 微生物學教研室 感染與免疫學實驗室，貴州 貴陽 550000；

2.貴州醫科大學臨床醫學院，貴州 貴陽 550000

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的消化系統腫瘤之一，全球腫瘤發病率位居第三位[1]，多數結直腸癌患者確診時已進入中晚期進而發生結直腸癌的轉移和侵襲[2]。目前結直腸癌的治療手段主要是手術切除、放療和化療[3]，雖然不斷有新的治療方案[4]，但其遠期生存率仍較低。因此，迫切需要新的方式來治療結直腸癌轉移和侵襲。水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）能夠選擇性殺滅腫瘤細胞，但不影響正常細胞，是一種很有前途的治療癌癥的新型溶瘤病毒[5]。VSV 可治療小鼠結直腸癌轉移[6]和抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移[7]。國內外少有報道VSV 對結直腸癌細胞遷移和侵襲的影響及機制。因此，本研究探討VSV 對結腸癌SW480 細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探究其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人結腸癌細胞株SW480、綠猴腎上皮細胞Vero、VSV（貴州醫科大學基礎醫學院感染與免疫學教研室）；抗MMP-2 抗體（Proteintech 公司）；抗MMP-9 抗體（SAB 公司）；抗GAPDH 抗體（Abcam公司）；二抗（兔抗，普美生物公司）；二甲基亞砜、胎牛血清（四季青公司）；高糖DMEM、青霉素鏈霉素、胰蛋白酶EDTA（美國Gibco 公司）；PCR 熒光定量試劑盒、逆轉錄試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；CCK-8 試劑盒（同仁化學研究所）；Tanswell 小室、Matrigel 基質膠（美國Corning 公司）；4℃臺式離心機（丹麥LaboGene 公司）；酶標儀（美國BioTek 公司）；倒置顯微鏡、Real time PCR 儀、多功能凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞在含有10%胎牛血清、10×青鏈霉素的DMEM 培養基中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 實驗分組 細胞增殖實驗按照VSV 濃度（MOI=0.01、0.1、1、10、100） 和 時 間（24、48 h）設置分組；其余實驗分為3 組，即對照組、VSV（MOI=0.01、0.1）處理組。每組設置6 個復孔，所有實驗重復3 次。

1.2.3 VSV 增殖、濃縮 培養Vero 細胞，感染VSV 1 周后收集病毒。采用聚乙二醇法濃縮病毒，離心后棄上清，以無血清的DMEM 重懸沉淀，分裝后放入-80℃冰箱保存。滴度測定：按Reed-Muench 法計算TCID50。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖情況 采用CCK-8法檢測VSV 對SW480 細胞的增殖抑制作用，SW480 細胞接種于96 孔板，待細胞貼壁后，VSV 處理組加入不同濃度的VSV，對照組加入等量的培養液。分別培養24、48 h，每孔加入10μl CCK-8 檢測液，在培養箱中孵育2 h，在490 nm 處檢測吸光度（A）值，每組6 個復孔計算平均值。

1.2.5 細胞劃痕愈合實驗 在6 孔板中接種2 ml SW480 細胞懸液（5×105個/孔），當細胞生長鋪滿孔底到90%，用槍頭垂直與細胞板底部劃線，PBS沖洗脫落細胞，用VSV 處理細胞，并設置陰性對照組，培養箱中培養，0、24、48 h 時在倒置顯微鏡下觀察并拍照，用Image J 軟件進行分析。

1.2.6 Transwell 實驗 使用24 孔板和8μm 孔徑的聚對苯二甲酸乙二醇酯過濾膜插入物來測定細胞的侵襲能力。小室預先涂有Matrix，5×104個細胞加入上室，20%胎牛血清的DMEM 充入下室。下室的入侵細胞培養24 h 后用甲醇固定20 min，0.1%結晶紫染色，倒置顯微鏡下計數。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶反應（qPCR） 總RNA 從VSV 處 理 的SW480 細 胞 中 按 照RNA提取試劑盒提取。采用cDNA 合成試劑盒逆轉 錄，以GAPDH 為 內 參 對 照，采 用2-ΔΔCT計算相對mRNA 表達水平。MMP-2 引物序列上游5’-TTGACGGTAAGGACGGACTC-3’， 下 游5’-GGCGTTCCCATACTTCACAC-3’；MMP-9 引物序列上游5’-GCCACTACTGTGCCTTTGAGTC-3’，下游5’-CCCTCAGAGAATCGCCAGTACT-3’；GAPDH引物序列上游5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，下游5’-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3’。

1.2.8 Western blot 檢 測 蛋 白 表 達 VSV 處 理SW480細胞，加入細胞裂解液混勻，在冰上裂解1 h，4℃、12 000 r/min 離心40 min，取上清，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取等量蛋白上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至聚偏二氟乙烯（PVDE）膜，5%脫脂奶粉封閉目的條帶PVDF 膜2 h，PBST洗膜3 次；加入一抗4℃孵育過夜，PBST 洗膜3 次；加二抗室溫孵育1 h，PBST 洗膜3 次；ECL 試劑顯色。以GAPDH 為內參蛋白，應用Image J 對灰度值進行統計分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VSV擴增及滴度測定

VSV 感染Vero 細胞后，出現細胞變圓、脫落現 象。病 毒TCID50 約 為1×107.386，PFUs 約 為1.7×107pfu/ml。

2.2 VSV對SW480細胞增殖能力的影響

不 同 濃 度（MOI=100、10、1、0.1、0.01）的VSV在24、48 h 作用SW480，24、48 h 細胞增殖率見表1、圖1，VSV 處理組細胞增殖率低于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。

表1 結腸癌SW480細胞增殖率的檢測（%，x ± s）

圖1 VSV 對結腸癌SW480 細胞增殖能力的影響

2.3 VSV對SW480細胞遷移能力的影響

劃痕實驗顯示，24 h SW480 細胞對照組遷移率為（15.813±0.368）%，MOI 為0.01 和0.1 的VSV處理SW480 細胞遷移率分別為（5.873±0.393）%和（2.530±0.345）%（t=7.912，P＜ 0.001）；48 h對照組遷移率為（21.000±0.380）%，MOI=0.01、0.1 的VSV 處 理SW480 細 胞 遷 移 率 分 別 為（8.950±0.552）% 和（7.772±0.290）%（t=20.180，P＜ 0.001），VSV 處理組細胞遷移率低于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖2。Transwell 實驗顯示，對照組和VSV 處理組細胞遷移數分別為（375.000±13.233）和（61.560±2.520）個/HP，VSV處理組細胞遷移數低于對照組，差異有統計學意義（t=8.060，P=0.001），見圖3。

圖2 VSV 對SW480 細胞遷移能力的影響（100×）

圖3 VSV 對SW480 細胞遷移能力的影響（結晶紫染色200×）

2.4 VSV對SW480細胞侵襲能力的影響

Transwell 實驗結果示，對照組和VSV 處理組（MOI=0.1）侵襲細胞數分別為（71.650±0.584）和（16.651±0.580）個/HP，VSV 處理組（MOI=0.1）細胞侵襲數低于對照組，差異有統計學意義（t=23.330，P＜ 0.0001），見圖4。

圖4 VSV 對SW480 細胞侵襲能力的影響（結晶紫染色200×）

2.5 VSV對SW480細胞中MMP-9表達的影響

qPCR 結 果 顯 示，SW480 細 胞 對 照 組MMP-2 mRNA 表達量為（1.000±0.090），MOI=0.01 的VSV 處理組細胞的MMP-2 mRNA 表達量為（1.055±0.119），與對照組相比差異無統計學意義（P＞ 0.05），MOI=0.1的VSV 處理組細胞的MMP-2 mRNA 表達量為（1.880±0.100），VSV處理組MMP-2表達量高于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；對照組MMP-9 mRNA 表達 量 為（1.020±0.154），MOI=0.01 的VSV 處 理 組細胞的MMP-9 mRNA 表達量為（0.832±0.153），與對照組相比差異無統計學意義（P＞ 0.05），MOI=0.1的VSV 處理組細胞的MMP-9 mRNA 表達量為（0.610±0.090），VSV 處理組MMP-9 表達量低于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖5。

Western blot 結 果 顯 示，SW480 細 胞 對 照組MMP-2 蛋 白 表 達 水 平 為（0.847±0.022），MOI=0.01 的VSV 處理組MMP-2 蛋白表達水平為（0.980±0.025），MOI=0.1 的VSV 處理組MMP-2 蛋白表達水平為（1.338±0.034），VSV 處理組MMP-2表達量高于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖5；SW480 細胞對照組MMP-9 蛋白表達水平為（0.777±0.020），MOI=0.01 的VSV 處理組MMP-9蛋白表達水平為（0.473±0.012），MOI=0.1 的VSV處理組MMP-9 蛋白表達水平為（0.497±0.013），VSV 處理組MMP-9 表達量低于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖6。

圖5 VSV 對SW480 細胞中基質金屬蛋白mRNA 表達的影響

圖6 VSV 對SW480 細胞中基質金屬蛋白的蛋白表達的影響

3 討論

CRC 是一種全球發病率較高的疾病，在癌癥病死中排名第五[8-9]。隨著腫瘤階段的進展，轉移的發生使CRC 的病死率增加[10]。一種新型的生物治療方法溶瘤病毒現已進入臨床研究[11-12]。已有研究表明VSV 可逆轉卵巢癌VEGF-D 的過表達，抑制MMP-2 表達來抑制卵巢癌的轉移[7]，還可治療小鼠肝結直腸癌轉移[6]。rVSV-NDV/F（L289A）能夠治療多病灶的肝轉移和肺轉移CRC 的老鼠模型[13]，但VSV 對結直腸癌遷移和侵襲影響的作用機制現在還不清楚。本研究對不同濃度VSV 的抗腫瘤作用進行了評價，結果表明VSV 具有抑制結腸癌SW480 細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

基質金屬蛋白是鋅依賴的內肽酶家族，可以降解細胞外基質成分，破壞癌細胞侵襲的組織學屏障[14]。在目前發現的所有MMP 蛋白中，MMP-2和MMP-9 被認為是參與腫瘤遷移和侵襲的最重要成員[15]。MMP-2 和MMP-9 的高表達在結直腸癌中較為常見[16]，預示著結直腸癌患者預后不良[17]。PI3K/Akt 信 號 通 路 是MMP-2 和MMP-9的重要上游調控因子[18]。激活PI3K/Akt 通過上調MMP-2 或MMP-9 表達促進CRC 侵襲轉移[19]。研究證明NDV D90 通過抑制MMP-2 和MMP-9的表達和活性，顯著抑制了口腔鱗狀癌細胞的遷移和侵襲[20]。但研究VSV 作用結直腸癌細胞后MMP-2 和MMP-9 表達的報道較少。為評估VSV對結直腸癌細胞的抑制作用與MMP-2、MMP-9 的關系，本研究采用qPCR 和蛋白質印跡法檢測VSV對SW480 細胞中MMP-2、MMP-9 表達的影響，結果顯示VSV 上調SW480 細胞中MMP-2 的表達和下調MMP-9 的表達。已有研究報道VSV 的基質蛋白可逆轉VEGF-D 增強卵巢癌細胞侵襲、遷移、淋巴結轉移和淋巴管生成，抑制腫瘤生長，進而抑制MMP-2 的表達[7]。溶瘤病毒（VSV-M51R）結合MMP-3 抑制劑可治療小鼠結腸癌[21]。本研究SW480 細胞中MMP-2 的表達，與文獻報道的VSV 在卵巢癌細胞中結果相反[7]，因此，VSV 可能通過上調MMP-2 和下調MMP-9 的表達，抑制結腸癌細胞的遷移，從而發揮抗腫瘤作用。

綜上，VSV 能夠抑制結腸癌SW480 細胞的遷移和侵襲，其內部分子機制可能是VSV 通過調控基質金屬蛋白的表達和活性來抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲，猜想可能是通過PI3K/Akt 通路來下調MMP-9 的表達的，之后再進一步進行實驗來研究其具體機制。VSV 可能是一種有前途的策略，為轉移性結直腸癌的治療提供了一個新的思路。