乳桿菌與幽門螺桿菌共聚集的特性研究

李露露，王鈞豪，葉亞明，趙學超，向衛兵，朱鵬飛，翟齊嘯*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(湖北均瑤大健康飲品股份有限公司，湖北 宜昌，443100)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)是國際公認的致病菌，可引起慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等疾病。世界上超過50%的人口感染了這種細菌，并且感染患者的病情嚴重程度與體內H.pylori的數量密切相關[1]。目前，根除H.pylori感染的治療方法是由《馬斯特里赫特IV/佛羅倫薩共識報告》推薦的三聯療法或含鉍四聯療法，10 d治療根除率超過90%[2-3]。除了抗生素療法外，還有許多輔助治療H.pylori感染的飲食療法。有研究報道印度苦楝樹防風草內酯的乙醇提取物可降低與H.pylori感染相關的免疫因子(NF-κB和IL-8)的活性和分泌量，即緩解H.pylori介導的炎癥。除此之外，通過細胞或小鼠實驗證實了一些植物，如土荊芥、石蓮子等的提取物對H.pylori的感染有拮抗作用[4-5]。

此外，乳桿菌的補充療法也被認為是治療H.pylori感染的另一有效方法[6]。遺傳學上不同的2個細菌(如乳桿菌與致病菌H.pylori)通過菌體表面的特定分子相互連接，結合形成大分子聚集體的過程叫做細菌的共聚集[7]。特異性共聚集作為一種恢復穩態的手段，在疾病治療中已經被廣泛討論[8-9]。乳桿菌可通過在口腔、陰道、胃腸道內共聚集致病菌，阻止致病性生物膜的形成，從而減緩疾病的發展[10-11]。乳桿菌除可與H.pylori[11]發生共聚集外，還可與大腸桿菌(Escherichiacoli)[12]、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)[13]、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)[12]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[14]、無毒李斯特菌(Listerianontoxic)[13]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[15]和空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)[16]等常見病原菌發生不同強度的共聚集(共聚集率在4%～80%)。世界范圍內的多項臨床研究表明，可共聚集H.pylori的益生菌DSMZ17648(Pylopass/Lonza)具有良好的臨床表現，患者在連續補充益生菌14 d后，H.pylori水平(13C呼氣值)顯著降低[11, 17]。但是關于乳桿菌發生聚集分子機制的解釋各不相同，其機理可能是簡單的表面靜電效應和表面疏水性導致的聚集[13]，也可能是帶有表面電荷的乳桿菌與帶有相反電荷的凝集素或與菌體本身帶有相反電荷的細菌發生共聚集[18]。此外，蛋白類凝集素(包括菌毛、鞭毛、大黏附素、小β-蛋白等[19-20])也可以使細菌發生非吸附性的自動聚集或共聚集。有學者認為共聚集相互作用通常涉及細胞表面相關的凝集素樣蛋白黏連素，這種蛋白能夠識別并結合伴生物種細胞表面含有輔助多糖的受體[21-22]。

乳桿菌與H.pylori的共聚集與多種因素有關，如細菌的培養方式(需氧度、培養基含糖量等)、pH、溫度、表面疏水性、蛋白酶和碳水化合物的干預等[23]。由于胃部的特殊環境需求，溫度、pH和穩定性(孵育轉速)是篩選益生菌時必須考慮的因素。HOLZ等[11]已經證實噴霧干燥的DSM17648乳桿菌與未處理細菌誘導共聚集體無顯著差異。而FKMEKCI等[10]研究了陰道環境中的乳桿菌與大腸桿菌的共聚集，發現pH值、溫度、疏水性、好氧或厭氧條件、某些酶和高碘酸鈉等因素都可以顯著影響菌株間的共聚率。

雖然目前有很多關于某一乳桿菌與致病菌的共聚集的體內和體外研究，但是還沒有對不同種乳桿菌與H.pylori的聚集特性的系統性研究，且缺乏差異菌株的比較基因組分析討論。因此本研究旨在從不同種乳桿菌中篩選出對H.pylori具有共聚集活性的乳桿菌，并探究乳桿菌表面疏水性、時間、溫度、pH、超聲波處理和孵育轉速等因素對共聚集能力的影響。同時運用比較基因組分析，預測乳桿菌與H.pylori聚集作用的結合位點(表面蛋白質或多糖)及相關基因。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

MRS培養基、BHI完全培養基、牛肉膏、NaCl、KH2PO4、K2HPO4、甘油、磷酸鹽緩沖溶液、二甲苯，國藥化學試劑有限公司；胃蛋白酶(10 000 U)、高碘酸鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA SE)熒光染色劑，碧云天生物技術；胎牛血清，南京森貝伽生物科技有限公司。

SU8100冷場發射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；FV3000激光共聚焦顯微鏡， 日本Olympus公司; BSC-1000Ⅱ A2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司；GRP-9080恒溫恒濕培養箱，上海森信公司；i160三氣培養箱、MULTISCAN GO全波長多功能自動酶標儀，美國Thermo Fisher公司。

1.2 菌株的培養

H.pyloriSS1菌株受贈于南方醫科大學陳燁教授團隊。將H.pyloriSS1接種于含5%(體積分數)胎牛血清的BHI完全培養基中，在三氣培養箱中培養3～4 d。

實驗所需的乳桿菌菌株均取自江南大學(中國無錫)食品學院生物技術中心菌種保藏庫(乳桿菌均從新疆、四川、西藏等省份的健康人腸道或泡菜樣品中分離得到)。將乳桿菌接種于MRS培養基，在37 ℃恒溫培養箱中培養18 h。

1.3 共聚集菌株的篩選

根據EKMEKCI等[10]的方法并稍加改良。取培養超過3代的乳桿菌離心，用PBS(pH=7.42±0.02)洗滌培養物2次，并重懸于無菌的PBS中；配制人工胃液(3 g/L胃蛋白酶，5 g/L NaCl)，并調節pH=4.00±0.02。用同樣的方法收集培養3代后的H.pyloriSS1，進行洗滌、重懸于人工胃液中。使用全自動酶標儀調節乳桿菌和H.pylori的菌懸液OD600 nm=0.50±0.02，即菌液濃度標準化(107～108CFU/mL)。

將等體積的乳桿菌懸液(2 mL)與H.pylori懸液(2 mL)混合，用旋渦振蕩器混合至少10 s。在室溫條件下孵育2 h后，用分光光度計測定此時混合菌液上清液的吸光度，共聚率按公式(1)計算：

(1)

式中：ODL，乳桿菌在600 nm處的吸光度；ODHP，H.pylori在600 nm處的吸光度；ODmix，混合菌液在600 nm處的吸光度。

1.4 掃描電子顯微鏡分析

據1.3的方法制備乳桿菌和H.pyloriSS1菌懸液，并在相應的緩沖液(PBS或人工胃液)中重懸。乳桿菌和H.pyloriSS1以等體積比混合，誘導產生共聚體。在室溫孵育2 h后，離心得到共聚體，用4%的戊二醛固定液重懸，置于4 ℃冰箱中固定過夜。次日固定好的共聚體使用不同體積分數的乙醇溶液(70%、80%、90%、95%、100%、100%)進行梯度脫水，每次脫水10 min。室溫晾干，充分揮發有機試劑后，用保鮮膜包裹放置樣品的平皿，戳孔后進行真空冷凍干燥處理。最后用鈀濺射制備樣品，采用冷場發射掃描電子顯微鏡對樣品掃描觀察[24]，放大倍數為5 000×，12 000×。

1.5 激光共聚焦顯微鏡分析

按1.3的方法制備H.pyloriSS1的菌懸液，使用熒光染料CFDA SE染色，37 ℃孵育15 min。然后將菌體重新懸浮在BHI完全培養基中，避光處理30 min，以去除多余的染料。根據BASCHONG等[25]的方法，將預染后的H.pyloriSS1和乳桿菌混合，按照上述方法進行共聚集試驗。孵育后收集混合菌液，滴1滴在玻片上，用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，操作條件為Ex=494 nm,Em=521 nm。

1.6 乳桿菌的表面疏水性

按EKMEKCI等[10]的方法進行測定。通過離心收集3代后的乳桿菌培養物，沖洗2次后，將其重新懸浮在OD600=0.6±0.02的PBS中。然后，將用于測試的碳氫化合物(二甲苯，1 mL)添加到乳桿菌懸液中(3 mL)。用旋渦混合器混合90 s，懸浮液靜置至少30 min，使兩相完全分離。靜置結束后，測定水相的OD600，按公式(2)計算各菌株的表面疏水性：

(2)

式中：ODbefore，混合前乳桿菌的吸光度；ODafter，混合后菌液水相的吸光度。

1.7 乳桿菌的其他處理

按1.3的方法制備乳桿菌和H.pyloriSS1菌懸液，并重懸于適當的緩沖液中。測試共培養不同時間(4～180 min)下乳桿菌與H.pylori共聚率的變化。將混合后的菌株混合液暴露在不同的溫度(4、37、80 ℃)和不同的pH環境中(pH=3～9)，計算共聚率的變化。另外，測試乳桿菌與H.pyloriSS1混合液在不同轉速(0、150、250 r/min)下孵育2 h后的共聚集能力。

按1.3的方法制備乳桿菌和H.pyloriSS1菌懸液，并重懸于適當的緩沖液中。使用細胞超聲波破碎儀對乳桿菌細胞超聲波處理12 min，比較超聲與未超聲組的共聚率。

1.8 比較基因組分析

使用Illumina HiSeq 2000對共聚集表現不同的同種乳桿菌進行測序，得到全基因組草圖，測序部分由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。將拼接好的乳桿菌的基因組序列進行基因功能注釋，通過BLAST方法(版本：BLAST+2.9.0；主要參數設置：e-value<10-5，identity>80%)與蛋白質直系同源簇數據庫(Clusters of orthologous groups of proteins，COGs，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG)進行比對，找出同源相近的基因對編碼蛋白進行功能分配[26]。

1.9 數據統計分析

所有實驗重復3次結果以平均值±標準差表示。使用Dunnett檢驗和對照組之間的差異進行評估，單因素方差分析認為P<0.05即為差異顯著。使用SPSS 13.0軟件進行統計計算。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌和H. pylori的共聚集

關于乳桿菌的聚集特性有很多報道，包括其自聚集和與病原菌的協同共聚集[27]。EKMEKCI等[10]研究了來自陰道的19種乳桿菌與大腸桿菌的共聚集，發現它們的共聚集率在15%～53%。本研究選取江南大學食品生物技術中心菌種保藏庫的57株乳桿菌進行H.pylori體外共聚集試驗，如圖1所示，除少數菌株不存在共聚集現象，乳桿菌與H.pylori的共聚率主要在10%～60%。HOLZ等[11]將羅伊氏乳桿菌DSM17648與H.pylori共聚集，可觀察到白色的絮凝體，與本實驗結果一致。此外，本研究中共聚集現象無種間差異，有株間顯著差異。COLLADO等[28]檢測的益生菌和病原體的聚集能力也呈現出株間特異性。在測試的乳桿菌菌株中，北酸乳桿菌(Lactobacilluskitasatonis)Guxi82GMM、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)984、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)GL14、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)JSSZ21、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)S5等表現出顯著的高共聚集率(共聚率>40%)。從中選出3株具有共聚集效果代表性的菌株(北酸乳桿菌Guxi82GMM、羅伊氏乳桿菌984和鼠李糖乳桿菌FS75)進行影響因素分析。

圖1 乳桿菌菌株的共聚集能力Fig.1 The co-aggregation ability of Lactobacillus spp.strains注：數據采用單因素方差分析，與對照組Pylopass進行比較*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1(下同)

如圖2所示，北酸乳桿菌Guxi82GMM和H.pylori的共聚集發生較為迅速，可以在10 min內達到較高的共聚率，這與HOLZ等[11]提出的觀點一致，專利菌株DSM17648(Pylopass)與H.pylori混合后在數秒內發生共聚集。TONOIKE等[29]稱乳桿菌和酵母的聚集特性與2種細菌細胞間的靜電作用力有關，這可能也是導致乳桿菌和H.pylori發生共聚集的速度較快的原因之一。

圖2 孵育時間對共聚集速率的影響Fig.2 Effect of incubation time on the co-aggregation rate

2.2 電子顯微鏡表征共聚集

使用掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡進一步證實共聚集的存在。首先用CFDA SE對共聚集體中的H.pylori進行熒光染色，以確認2種細菌(H.pylori和乳桿菌)都存在于共聚體內。圖3-b的明場視圖可以同時觀察到北酸乳桿菌Guxi82GMM和H.pyloriSS1，并且二者互相聚集。

a-暗場；b-明場；c-疊加場圖3 激光共聚焦顯微鏡分析Fig.3 Confocal laser scanning microscopy analysis注：帶有CFDA SE的H. pylori呈綠色，圖中的箭頭指示為聚集體

隨后收集共聚集形成的聚集體，進行真空冷凍干燥處理，取凍干后的樣品置于冷場發射掃描電子顯微鏡下觀察。由于北酸乳桿菌是近幾年從嗜酸乳桿菌中發現并分離出來的乳桿菌新種，所以在此補充了嗜酸乳桿菌S5的掃描電鏡圖與之作對比。圖4-a、圖4-b顯示了單獨的H.pylori和乳桿菌的形態，H.pyloriSS1呈彎曲的桿狀，嗜酸乳桿菌S5表現為細長的桿狀，二者的區別度較高。圖4-d～圖4-f顯示的是北酸乳桿菌Guxi82GMM和嗜酸乳桿菌S5分別與H.pyloriSS1形成的聚集體的結合形態。圖4-e、4-f中白色的箭頭處所示，多個H.pylori菌體與1個北酸乳桿菌Guxi82GMM或嗜酸乳桿菌S5結合，并且乳桿菌之間存在自聚集的現象，從而2種菌相互交聯形成更大的共聚集物。電子顯微鏡下未發現菌株表面特殊的結合位點，這與HOLZ等[11]報道的結果一致。

a-H. pylori SS1；b-L.acidophilus S5；c～d-H. pylori SS1和L.kitasatonis Guxi82GMM的聚集體；e～f-H. pylori SS1和L.acidophilus S5的聚集體圖4 掃描電子顯微鏡分析Fig.4 Scanning electron microscopy analysis

2.3 共聚集的影響因素

乳桿菌與H.pyloriSS1的共聚集作用與乳桿菌菌體的表面成分有關，溫度和pH值是益生菌生長的2個重要生理指標。乳桿菌本身對溫度敏感，4、37、85 ℃分別代表它的休眠、最佳生長和失活狀態。實驗結果表明共聚集可發生在任何溫度，37 ℃下的共聚率最高的菌株在所有溫度下均表現出最好的共聚特性，且80 ℃處理2 h后滅活的乳桿菌仍具有較強的共聚集能力(圖5-a)。此前已有報道稱嗜酸乳桿菌S1和大腸桿菌ATCC 11229在不同的pH值和溫度下均可以有效地共聚集[10]。為了確定環境pH對共聚集的影響，將乳桿菌在不同pH下進行預處理，檢測細菌共聚集的變化(圖5-b)。空腹時胃部是一種高酸性的環境(pH≤2.0)，在進食后約2 h胃液被稀釋，pH值將升至3.0～5.0。在本研究中在很寬的pH范圍內(pH=3.0～9.0)均可以觀察到共聚集活性，并且隨著pH的降低，共聚率更高，這或許與乳桿菌表面蛋白的變性有關。

人體的消化系統常伴有由胃腸道蠕動和身體運動引起的剪切力。只有當益生菌能夠克服剪切力的作用和病原菌發生共聚集時，胃內的H.pylori才能被順利地排出體外。孵育轉速可以用來反映剪切力的大小，如圖5-c所示，在0～150 r/min的孵育轉速下，乳桿菌與H.pylori的共聚集作用無顯著差異。當速度達到250 r/min時，共聚率略有下降，但仍保持在較高水平。鼠李糖乳桿菌FS75的共聚效果差，共聚率始終低于20%。對乳桿菌進行超聲波處理以去除其表面結構(圖5-d)，超聲波處理后的羅伊氏乳桿菌984共聚集率略低于未進行超聲波處理的細胞，但北酸乳桿菌Guxi82GMM和鼠李糖乳桿菌FS75的無顯著變化。

黏附是一個復雜的過程，包括疏水性和配體-受體機制，細胞表面特性往往在細菌黏附中起重要作用。細菌共聚集也是細胞黏附的一種，所以它具有與黏附相同的性質。在一些乳桿菌菌株中，已經觀察到黏附能力和疏水性之間存在相關性，這是由微生物對烴類的黏附決定的[30]。乳桿菌與二甲苯混合測定表面疏水性的結果如圖5-e所示，乳桿菌的表面疏水性在20%～90%。其中表現出較高共聚集活性的羅伊氏乳桿菌984和北酸乳桿菌Guxi82GMM，同時也表現出較高的表面疏水性，反之，效果不好的鼠李糖乳桿菌FS75和保加利亞乳桿菌BJLY1的表面疏水率顯著低于前者。這與前人的報道結果一致[10]，微生物的細胞表面化學研究表明，細胞表面蛋白質上乙二醇基團的存在導致了更高的疏水性，而親水表面則與多糖的存在有關。這個結果提示我們乳桿菌的聚集特性與菌體表面的蛋白組成相關。

a-溫度；b-pH；c-孵育轉速；d-超聲處理；e-乳桿菌的表面疏水性圖5 乳桿菌共聚集的影響因素Fig.5 Influencing factors on the co-aggregation of Lactobacillus

2.4 比較基因組分析

SCHACHTSIEK等[16]通過研究棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)與大腸桿菌和空腸彎曲菌的聚集，發現了乳桿菌的表面存在1個分子質量為19.9 kDa的共聚集啟動子。此外，S層蛋白和胞外多糖也被證明與聚集相關[31]。由此我們推測乳桿菌與H.pylori之間的共聚集機制也可能與細菌表面蛋白質和多糖的結構有關。另一方面，通過比較基因組分析作用機制已經被證實是一種可行的方法，如LIU等[32]通過差異基因分析解釋了乳桿菌對腸易激綜合征的緩解作用。將初篩得到的部分乳桿菌進行全基因組草圖測序，選取同種乳桿菌中不同共聚集表現的菌株進行比較基因組的分析。基于篩菌實驗及影響因素的分析，3株具有代表性的乳桿菌中，羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的遺傳背景、生理特性等方面已經研究得較為透徹，是常見的益生菌種類，而關于北酸乳桿菌的研究較少，且缺乏對照菌株。因此本研究選取羅伊氏乳桿菌(984和1381)和鼠李糖乳桿菌(JSSZ21和FS75)中具有共聚集表現差異的菌株進行比較基因組學分析(基因草圖原始數據見電子版增強出版附件http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031353)。同源基因分析顯示，羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的核心基因分別有1 510和2 399個(圖6-a)。進一步進行功能基因注釋，在共聚集表現較好的羅伊氏乳桿菌984和鼠李糖乳桿菌JSSZ21的基因組中，與氨基酸轉運和代謝相關的功能基因數量顯著高于共聚集表現較差的同種乳桿菌(圖6-b)。

如圖6-c，COG0531和COG0765分別是羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌中差異表達量最顯著的蛋白，共聚集能力好的菌株中COG0531和COG0765基因的數量多于共聚集能力差的菌株(拷貝數差異大于5)。COG0531與氨基酸合成代謝有關，NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)將其注釋為鎂轉運體CorA家族蛋白的成員。有報道稱CorA是細菌內膜的主要鎂轉運體，它在大腸桿菌中的過表達可以合成大部分蛋白質，形成包涵體。包涵體被包裹在原核細胞外源基因表達時形成的膜中，并且由致密的不溶性蛋白顆粒組成，不表現出生物活性[33]。因此可以推測，羅伊氏乳桿菌984中存在的大量COG0531相關基因，可促進CorA的表達，并與H.pylori形成類似包涵體的蛋白結構，以促進聚集的發生。

a-韋恩圖和進化樹；b-COG功能注釋；c-COG熱圖圖6 乳桿菌的比較基因組分析Fig.6 Comparative analysis of the genomes of Lactobacillus spp. strains

結合以上乳桿菌共聚集H.pylori的體外影響因素的探索，差異菌株的比較基因組研究為乳桿菌與H.pylori發生共聚集提供了合理的猜想，后續可以從乳桿菌表面的蛋白方面著手深入研究共聚集的分子機制。同時比較基因組的分析也為篩選具有潛在共聚集能力的益生菌奠定了基礎。

3 結論

綜上所述，本研究從乳桿菌屬中篩選得到5株與H.pylori具有較強共聚集能力的乳桿菌，通過電子顯微鏡進一步觀察共聚體結構發現，菌株間的共聚集不存在特殊的結合位點。影響因素實驗表明乳桿菌與H.pylori的共聚集作用可以快速、穩定地發生在胃酸環境中。不同于先前報道的拮抗H.pylori的益生菌，本研究中滅活狀態的乳桿菌依舊可以結合H.pylori，發揮益生功能。最后，本研究通過表面疏水性的測定和比較基因組找到了乳桿菌參與聚集作用的潛在功能基因，為篩選具有降低H.pylori載量的滅活益生菌提供了新的研究方向。但是對于乳桿菌共聚集H.pylori的物質基礎研究并不深入，后續可以利用乳桿菌的組分剝離、表面蛋白去除/提取和基因敲除等技術，進一步探究共聚集作用的物質基礎與功能基因，以期更加直觀地驗證本研究的結果。