基于底物通道工程提升嗜熱腈水合酶對煙腈的催化性能

張廣林，周哲敏

1(無錫新恒輝材料有限公司，江蘇 無錫，214072)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

煙酰胺是一種輔助性藥物，是煙酸的酰胺形式，眾多研究中表明其參與抗炎和抗衰老過程[1]，現(xiàn)已廣泛用于治療各種皮膚病，如高危人群的非黑色素瘤皮膚癌[2]。目前，工業(yè)上生物法產煙酰胺在漸漸取代化學合成法，主要是因為生物法大大提高了產物的純度，降低了可導致血管舒張等副作用的副產物煙酸[3]的含量，節(jié)約了分離成本。

腈水合酶(nitrile hydratase，NHase，EC 4.2.1.84)是一種金屬酶，在微生物的腈代謝過程中催化腈類化合物生成相應的酰胺。由于腈類及酰胺類化合物屬于有機溶劑，其對酶蛋白的損害較大，或改變了酶蛋白的構象，或導致酶蛋白表面必需水分子的丟失[4]，且水合反應是一個放熱反應。因此，尋求高穩(wěn)定性的腈水合酶一直是研究的熱點。

本課題組于2020年在GenBank數(shù)據(jù)庫中尋找到一種嗜熱菌溫泉熱堿芽胞桿菌(Caldalkalibacillusthermarum) TA2.A1來源的腈水合酶基因[Cal.tNHase，GenBank:EGL84005.1 (α亞基), EGL84004.1(β亞基)]，實現(xiàn)了其在大腸桿菌工程菌株內的異源表達，并初步研究了該酶的酶學性質和催化性能[5]。該酶穩(wěn)定性已滿足工業(yè)應用的需求，但其催化煙腈的活性尚有提升的空間。

在此之前，研究采用各種蛋白質工程的方法以提高NHase的催化活性，如結構域交換和亞基融合，然而，所獲得的NHase的性質并不總是令人滿意[6]。近年來，酶的底物通道受到越來越多的關注，其對酶的催化性能起著關鍵作用[7]。定制底物通道可以顯著提高酶的活性、選擇性和穩(wěn)定性，是一種新的有效策略[8-9]。本文將通過此方法來提高Cal.tNHase的活性，以提高其應用潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌JM109感受態(tài)用于基因克隆，大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)用于蛋白表達，均為實驗室前期保藏菌株；質粒 pET-24a(+)，由本實驗室保藏。

1.1.2 酶與主要試劑

Prime STAR MAX 高保真酶、Quick CutDpnI 消化酶，大連寶生物工程有限公司；3-氰基吡啶、煙酰胺，上海麥克林生化科技有限公司；葡萄糖、氨水、培養(yǎng)基中所用各種鹽類，國藥化學試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英國Oxoid公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0, 酵母提取物5.0, NaCl 10.0。

2YT培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨16.0, 酵母提取物10.0, NaCl 5.0, IPTG終濃度0.4 mmol/L, Co 0.1。

5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨16.0, 酵母提取物10.0, 葡萄糖10.0, KH2PO44.6, (NH4)2PO434.0, 二水合檸檬酸三鈉7.4, 微量元素母液10 mL。

補料培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖500.0, MgSO47.4, 酵母提取物12.0, 胰蛋白胨12.0。

誘導劑母液(g/100 mL)：IPTG 0.286, CoCl2·6H2O 1.8。

微量元素母液(g/L)：FeSO4·7H2O 10.0，CuSO4·5H2O 3.0，MnSO4·H2O 0.38，ZnSO4·7H2O 5.25，(NH4)6Mo7O240.11，Na2B4O7·10H2O 0.23，CaCl2·2H2O 2.65，溶于1 mol/L HCl中。

1.2 實驗方法

1.2.1 計算機半理性設計方法

Cal.tNHase的晶體結構目前尚未被解析。根據(jù)PSI-BLAST的檢索結果，該酶α亞基與來源于Bacillussp.RAPc8的腈水合酶(PDB ID:2DPP)的同源性為86%，其β亞基與來源于BacillussmithiiSC-J05-1的腈水合酶(PDB ID:1V29)同源性最高，達63.6%，于是以此為模板，使用trRosetta在線工具構建出Cal.tNHase的三維結構[10]。PROCHECK輸出的拉式圖[11](Ramachandran plot)表明所構建的模型是可靠的。隨后三維模型經NAMD軟件[12]進行50 ns的分子動力學模擬，繼續(xù)對其結構進行進一步優(yōu)化，所用力場為Charmm力場。底物通道的計算分析使用的是CAVER Analyst 2.0[13]軟件，最小探針半徑0.9 ?，檢測深度4 ?，底物通道起始位點為腈水合酶活性中心的幾何中心。

1.2.2 突變體庫的構建

以溫泉熱堿芽胞桿菌來源的腈水合酶構建的重組質粒 pET-24a(+)-Cal.tNHase 為模板，采取全質粒PCR對預測的突變位點進行單點的代表性氨基酸(A、D、F、H、K)突變，將構建好的質粒轉入E.coliJM109中，送測序，將測序結果正確的質粒重新轉入E.coliBL21(DE3)中備用。

1.2.3Cal.tNHase和突變體的表達與純化

將上述構建成功的菌株, 分別在含有50 g/mL卡那霉素的LB平板上劃線，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落置于含有50 g/mL卡那霉素的5 mL 2YT液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8～10 h將培養(yǎng)好的試管種子液以1%(體積分數(shù)，下同)的接種量轉接到含有50 g/mL卡那霉素的100 mL 2YT培養(yǎng)基搖瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，添加終濃度為0.4 mmol/L IPTG、0.1 g/L CoCl2·6H2O的誘導劑，30 ℃、200 r/min誘導14 h。

表1 本文所用引物及其序列Table 1 Primers used in this study

將上述培養(yǎng)的菌液以12 000 r/min離心后收集菌體，再用結合緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4、280 mmol/L NaCl、6 mmol/L KCl，pH 7.4)濃縮5倍后重懸浮，于超聲波破碎儀中以開3 s停7 s破碎20 min，然后將破碎液12 000 r/min離心30 min，取上清液過0.22 μm膜后置于冰上備用。純化使用strep親和層析，先準備好除菌且除氣泡的超純水、結合緩沖液、洗滌緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4、280 mmol/L NaCl、6 mmol/L KCl、2.5 mmol/L脫硫生物素，pH 7.4)。先用超純水將柱子中保存的乙醇溶液至少以5倍體積沖洗干凈;再用結合緩沖液平衡柱子，紫外吸收調零;上樣10～15 mL, 再以結合緩沖液平衡柱子，使紫外吸收降到0；然后用洗滌緩沖液洗脫，收集目的蛋白。純化結束后，將收集到的蛋白用Bradford法標定蛋白質量濃度，SDS-PAGE測定純度，最后將蛋白質量濃度調整到0.05 mg/mL備用。

1.2.4 水合活性的測定

腈水合酶反應體系：10 μL質量濃度0.05 mg/mL的蛋白或OD600=1的細胞液加入490 μL含200 mmol/L的3-氰基吡啶的水溶液，25 ℃下反應10 min，再加入500 μL乙腈進行終止。將反應后的樣品過0.22 μm的膜除菌，用HPLC過C18柱檢測其酶活力，流動相為V(乙腈)∶V(水)=1∶2的混合液，檢測波長215 nm，檢測溫度40 ℃，流動相流速0.6 mL/min，進樣量10 μL，監(jiān)測10 min，每組數(shù)據(jù)至少進行3次平行實驗。

酶活力定義：25 ℃下1 min內生成1 μmol煙酰胺所需要的酶量(U)。比酶活力定義為1 mg蛋白所具有的酶活力(U/mg)；細胞酶活力定義為1 mL發(fā)酵液細胞所具有的酶活力(U/mL)。

1.2.5 酶學性質研究

熱穩(wěn)定性：將NHase進行表達純化，統(tǒng)一調整蛋白質量濃度到0.1 mg/mL，將酶液置于金屬浴設備中，設置金屬浴設備溫度65 ℃，處理酶液0、0.2、0.5、1、2、4 h，取樣進行酶活力測定，定義每個酶在處理時間為0 h時酶活力為100%，分析其熱穩(wěn)定性。

底物及產物耐受性：將NHase進行培養(yǎng)誘導，然后離心菌液收集菌體，將OD600=8的菌體分別置于3-氰基吡啶濃度為0、1 mol/L和煙酰胺濃度為0、2 mol/L的水溶液中，25 ℃孵育30 min，12 000 r/min離心1 min后去除上清液，再用10 mmol/L的磷酸緩沖液清洗菌體2次，測其菌體酶活力，定義每個酶用不含3-氰基吡啶和煙酰胺水溶液處理后酶活力為100%，分析其底物及產物耐受性情況。

1.2.6 5 L罐產酶發(fā)酵

從-80 ℃保存的甘油管內用接種環(huán)沾取菌液，在含有50 g/mL卡那霉素的LB平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落與含有50 g/mL卡那霉素的30 mL LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8～10 h，再以1%接種量轉接于新鮮的含有50 g/mL卡那霉素的30 mL LB液體培養(yǎng)基中進行擴培7.5 h。最后將擴培后的菌液接入5 L發(fā)酵罐中，接種量為6%，卡那霉素添加量為0.1%(質量分數(shù))。發(fā)酵罐的初始培養(yǎng)體積為2 L，pH 7.0，培養(yǎng)溫度37 ℃，攪拌槳轉速200 r/min，通氣量3 L/min，此時將罐內的溶氧標定為100%。在接種后，發(fā)酵罐內的溶氧與轉速偶聯(lián)，維持溶氧在30%，最大通氣量為7 L/min，最大攪拌槳轉速1 000 r/min。發(fā)酵進行到6 h左右出現(xiàn)溶氧反彈現(xiàn)象，此時初始培養(yǎng)基中的碳源基本耗盡，開始以指數(shù)流加的方式進行補料，流加時控制菌體比生長速率μ=0.2 h-1。當細胞 OD600達到60左右時，降低溫度為30 ℃，以15 mL/h的恒流速流加誘導劑進行誘導，直至100 mL誘導劑全部補完。整個發(fā)酵過程中流加氨水進行pH調節(jié)，維持罐內發(fā)酵液pH=7.0。發(fā)酵過程在開始補料后以2 h間隔取樣，監(jiān)測其生長狀況，記錄OD600和葡萄糖濃度，樣品采用HPLC測定水合活性。

2 結果與分析

2.1 Cal.tNHase突變體的篩選

利用trRosetta在線建模工具構建了Cal.tNHase的三維結構模型，并使用PROCHECK獲取了所構建模型的拉式圖，拉式圖結果表明所構建的模型是可靠的(圖1)。

圖1 Cal.tNHase三維結構拉式圖Fig.1 Main Ramachandran plot of the constructed model of Cal.tNHase

在此基礎上，通過CAVER底物通道預測工具，預測定位了如圖2所示的8個位于底物通道上的氨基酸殘基αL89、βL37、βA41、βG42、βY46、βL48、βV121、βV126。

圖2 Cal.tNHase結構模型及其底物通道模型Fig.2 Cartoon model of Cal.tNHase and its substrate access tunnel

由于βLeu48位點已在前期研究中篩選，本研究對余下7個位點進行突變庫的構建。為提高篩選效率且保證突變體庫中氨基酸類型的全面性，將其分別突變?yōu)槠渌?種具有代表性氨基酸：側鏈帶負電的天冬氨酸(D)、帶芳香族側鏈的苯丙氨酸(F)、側鏈帶正電的賴氨酸、組氨酸(K、H)以及帶非極性側鏈的丙氨酸(A)，共計33個突變體，研究底物通道上氨基酸殘基的種類對腈水合酶活性的影響。首先，將野生型腈水合酶和突變體進行培養(yǎng)誘導，測其細胞酶活力。調整細胞液OD600=1，結果如圖3所示，野生型Cal.tNHase酶活力為21.4 U/mL，在這33個突變體中，αL89H、βG42K的酶活力有一定的提高，分別為37.8 和42.2 U/mL。

圖3 Cal.tNHase突變體細胞酶活力Fig.3 Catalytic activity of cells harboring Cal.tNHase mutants

為了進一步促進腈水合酶活力的提高，遂將αL89H和βG42K進行組合突變。野生型以及這3個突變體經誘導表達后分離純化，測得的比酶活力數(shù)據(jù)如圖4所示。突變體βG42K比酶活力為553.0 U/mg，是野生型(220.3 U/mg)的2.5倍，但在與αL89H進行組合突變后，酶活力未得到進一步提高。

a-突變化的表達純化；b-突變化比酶活力圖4 突變體表達純化及比酶活力比較Fig.4 Expression and purification of the mutants and their specific activities toward 3-cyanopyridine注：WT-野生型

2.2 Cal.tNHase-βG42K突變體的酶學性質

經過篩選得到的突變體βG42K催化活性得到了一定的提高，但可能使其穩(wěn)定性有所降低，所以從熱穩(wěn)定性、底物耐受性、產物耐受性方面與其野生型進行了比較，結果如圖5-a所示。野生型酶在65 ℃孵育3 h后仍保持其初始活性的50%左右，而βG42K突變體在65 ℃熱處理1.5 h后失去一半的活性，但在熱處理的過程中，βG42K突變體的比酶活力一直高于野生型。據(jù)報道，現(xiàn)有熱穩(wěn)定性最優(yōu)的腈水合酶來源于芽胞桿菌菌株RAPc8，該酶在50 ℃下熱處理2.5 h后可保持一半活性，然而在60 ℃下熱處理20 min后，活性喪失一半以上[14]。顯然，研究所獲得的突變體βG42K的熱穩(wěn)定性更具優(yōu)勢，具備一定的應用前景。

腈水合酶的水合過程能否持續(xù)進行與其本身對腈類底物或酰胺產品的耐受性有關。因此實驗中用高濃度的3-氰基吡啶和煙酰胺來處理Cal.tNHase野生型和βG42K突變體，檢測其殘余酶活力，分析酶的底物及產物耐受性。如圖5-b所示，突變體βG42K經1 mol/L 3-氰基吡啶處理30 min后，相對酶活力為48.2%，而Cal.tNHase野生型為59.3%。經2 mol/L煙酰胺處理30 min后，突變體βG42K保留了67.2%，野生型為63.3%(圖5-c)。

a-65 ℃熱處理時間;b-3-氰基吡啶濃度;c-煙酰胺濃度圖5 Cal.tNHase βG42K酶學性質Fig.5 Enzymatic properties of the Cal.tNHase bG42K

2.3 突變株5 L罐產酶發(fā)酵

經過上述驗證，突變體βG42K的催化性能基本滿足應用所需，遂將此菌株進行5 L罐的放大培養(yǎng)。采用分批補料的方式，在OD600=60時開始誘導，菌體前期培養(yǎng)溫度37 ℃，誘導溫度30 ℃。如圖6所示，整個補料過程中葡萄糖積累量不超過1 g/L，在發(fā)酵時長為25 h時菌體OD600最高為110，此時細胞酶活力是5 539.0 U/mL，為已報道的WANG等[15]研究中細胞酶活力的2倍，說明突變體βG42K相較于此前的研究在發(fā)酵酶活力方面更具優(yōu)勢。

圖6 突變株βG42K高密度發(fā)酵Fig.6 High-density fermentation of mutant strain βG42K

3 結論

本研究成功通過定制底物通道提高了Cal.tNHase的活力，篩選出的突變體βG42K比酶活力是其野生型的2.5倍。該突變體在65 ℃下的半衰期仍有1.5 h，且對底物3-氰基吡啶和產品煙酰胺的耐受性并未大幅度降低，能滿足工業(yè)生產的需要。通過對突變體βG42K進行放大發(fā)酵，在5 L罐上完成高密度發(fā)酵，細胞酶活力達到5 539.0 U/mL。