聚乙二醇在液態(tài)發(fā)酵功能紅曲莫納可林K中的應(yīng)用

許世錦，胡文林，陳羅華周，聶增宇，陳玲娟

(廣東天益生物科技有限公司，廣東 湛江，524300)

1979年ENDO等[1]在紅曲霉發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了一種能特異性地抑制膽固醇合成的物質(zhì)，該物質(zhì)與土曲霉(Aspergillusterreus)產(chǎn)的洛伐他汀(Lovastatin) 為同一物質(zhì)，將其命名為莫納可林K(Monacolin K，MK)，是目前臨床上被廣泛應(yīng)用的降膽固醇藥物之一[2-3]。目前，功能紅曲MK的生產(chǎn)均采用傳統(tǒng)的三角瓶固態(tài)發(fā)酵，鑒于固態(tài)發(fā)酵存在諸多弊端，現(xiàn)階段主要進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵的研究。由于紅曲菌產(chǎn)MK的代謝機(jī)制尚未明晰，故只能借鑒土曲霉中MK合成的途徑及酶系的鑒定和表征[4]。

甘油作為常用碳源之一，對(duì)紅曲菌生長和代謝起著重要作用，且不會(huì)產(chǎn)生碳代謝物的阻遏效應(yīng)[5]。目前采用甘油作碳源的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK，在搖瓶和15 L小型發(fā)酵罐中進(jìn)行的試驗(yàn)已取得成功[6]，但甘油作為發(fā)酵原料，既不符合GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，也不符合QB/T 2847—2007《功能性紅曲米(粉)》，無法量產(chǎn)，而采用純谷物淀粉為碳源的液態(tài)發(fā)酵，MK產(chǎn)量不足100 mg/L，產(chǎn)量低，成本高，亦無法量產(chǎn)。目前將表面活性劑作為發(fā)酵促進(jìn)劑的研究越來越多，主要應(yīng)用在以發(fā)酵法生產(chǎn)酶制劑[7]、氨基酸[8]、新材料[9-10]等工業(yè)領(lǐng)域，但上述研究均以傳統(tǒng)的表面活性劑為主，新型的表面活性劑的應(yīng)用研究不多[11]。近年來的研究表明，在液態(tài)發(fā)酵過程中加入非離子表面活性劑，通過萃取發(fā)酵的模式可以提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，并且不同的非離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞的生長與代謝機(jī)制不同[12-15]。然而， CHEN等[16]發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇PEG-4000作為萃取劑，在發(fā)酵過程中并沒有明顯的效果。為此本文擬研究聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)對(duì)紫色紅曲菌TY02發(fā)酵過程中MK產(chǎn)量的影響，探討PEG對(duì)紫色紅曲菌TY02的代謝調(diào)控機(jī)理，以期對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)且可利用谷物淀粉作為碳源的原料進(jìn)行發(fā)酵，能大幅提高紅曲菌代謝的MK產(chǎn)量，降低成本，從而為實(shí)現(xiàn)功能紅曲液態(tài)發(fā)酵的量產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

紫色紅曲菌(Monascuspurpureus)TY02，廣東天益生物科技有限公司保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC M2018586。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

HWY-2112型雙層恒溫培養(yǎng)搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；LC-20AD高效液相色譜儀、SPD-20A紫外分光檢測器，日本島津儀器有限公司；SW-CJ-1FD型超凈化工作臺(tái)，蘇州凈化器設(shè)備有限公司；LS-B50L型立式蒸汽滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠；LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9140A型鼓風(fēng)干燥箱、HWS-28型電熱恒溫水浴鍋、LRH-150型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；B2200S型超聲波清洗器，必能信超聲(上海)有限公司；MP502B型電子天平，上海精密實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：12°Bx麥芽汁培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨25，玉米漿10，NaNO32，MgSO4·7H2O 1，K2HPO4·3H2O 1.5，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：黏米粉80，大豆水解液45，玉米漿5，NaNO35，MgSO4·7H2O 1.25，K2HPO4·3H2O 2.5，pH 4.5。

上述培養(yǎng)基均121 ℃滅菌30 min。

1.3 培養(yǎng)條件及方法

斜面培養(yǎng)：挑取1環(huán)菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長滿斜面。

種子液培養(yǎng)：用10 mL無菌水洗滌試管斜面孢子，接種至100 mL種子液培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在30 ℃、180 r/min的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)48 h。

液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按10%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在30 ℃、180 r/min的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)3 d，然后于25 ℃發(fā)酵至第22天。

1.4 主因素效應(yīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取對(duì)MK代謝影響較大的黏米粉、PEG-2000、大豆水解液、玉米漿、MgSO4·7H2O、NaNO3、K2HPO4·3H2O作為Plackett-Burman設(shè)計(jì)的7個(gè)因素，每個(gè)因素取2個(gè)水平，高水平為低水平的1.5倍，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)各因素及其水平取值Table 1 Levels of factors for Plackett-Burman design

1.5 發(fā)酵液的預(yù)處理

固液分離：發(fā)酵液經(jīng)抽真空過濾，分離得菌體和濾液，菌體再經(jīng)蒸餾水洗滌2～3次，再過濾得菌體，并收集濾液。首次分離得到的濾液與洗滌所得的濾液匯總，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)加入的蒸餾水?dāng)?shù)量，以便確定體積的換算系數(shù)。菌體經(jīng)低溫干燥及粉碎得固態(tài)產(chǎn)品。

PEG的去除：在固液分離得到的濾液中，分別加入0.005 mol/L K4[Fe(CN)6]溶液使終質(zhì)量濃度為0.01 g/L(此為初始培養(yǎng)基中PEG為5 g/L時(shí)的用量，其余濃度PEG的溶液添加量可依此類推)，0.01 mol/L NaCl 0.4 g/L，攪拌均勻，靜置沉淀10 min，抽真空過濾，分離后取濾液、棄渣。

過量K4[Fe(CN)6]的去除：在上述濾液中，加入0.005 mol/L ZnSO4溶液使終質(zhì)量濃度為0.05 g/L(此為初始培養(yǎng)基中PEG為5 g/L時(shí)的用量，其余濃度PEG的溶液添加量可依此類推)，攪拌均勻，靜置沉淀10 min，抽真空過濾，分離后取濾液、棄渣，備用。

1.6 分析方法

菌體量的測定：菌體量采用干重法測定，用3層紗布過濾發(fā)酵液，蒸餾水洗滌2～3次，擰干，在60 ℃烘箱中烘干至恒重，生物量按公式(1)計(jì)算[17]：

(1)

發(fā)酵液的預(yù)處理：稱取發(fā)酵液5 g，加入35 mL 75%分析純乙醇，超聲波萃取50 min，然后再加入適量的75%分析純乙醇，再超聲波萃取10 min，冷卻后定容至50 mL，3 500 r/min離心10 min，然后用0.45 μm的有機(jī)微孔濾膜過濾，濾液用于測定MK，測定的MK為總MK。胞外MK的測定以發(fā)酵醪液經(jīng)過濾后的濾液為樣品，樣品預(yù)處理方法和測定方法與總MK測定相同。

色譜條件：色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm)；柱溫：20～25 ℃；紫外檢測器SPD-20A：檢測波長238 nm；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=385∶115∶0.14；流速1.0 mL/min；進(jìn)料量20 μL。

MK參照QB/T 2847—2007《功能性紅曲米(粉)》中的方法測定；PEG參照文獻(xiàn)[18]的方法測定；K4[Fe(CN)6]參照GB/T 13025.10—2003中的方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG分子質(zhì)量對(duì)紫色紅曲菌TY02生長和 MK代謝的影響

在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)分別添加0.5 g/L PEG-400、PEG-600、PEG-800、PEG-1000、PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000進(jìn)行培養(yǎng)，菌體生物量、MK的質(zhì)量濃度與PEG分子質(zhì)量的關(guān)系如圖1所示。

圖1 PEG的分子質(zhì)量對(duì)紫色紅曲菌TY02生長和 MK代謝的影響Fig.1 Effect of molecular weight of PEG on the growth and MK metabolism of Monascus purpureus TY02

由圖1可知，隨著添加PEG分子質(zhì)量的增加，紫色紅曲菌TY02的生長與代謝均呈遞增趨勢(shì)，體現(xiàn)在菌體生物量與產(chǎn)MK均呈正增長，至分子質(zhì)量達(dá)到2 kDa時(shí)，菌體生物量與產(chǎn)MK均達(dá)極值，此時(shí)生物量為46.70 g/L，MK產(chǎn)量為469 mg/L，分別為對(duì)照生物量(32.28 g/L)的1.45倍和MK產(chǎn)量(63 mg/L)的7.44倍，此后，隨著分子質(zhì)量的進(jìn)一步提高，生物量與MK會(huì)逐步下降，說明分子質(zhì)量過大會(huì)抑制菌體的生長和MK的分泌。

2.2 PEG-2000濃度對(duì)TY02的MK代謝影響

在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)分別添加0、0.5、1、5、10、15、20 g/L的PEG-2000進(jìn)行培養(yǎng)，MK的產(chǎn)量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系如圖2所示。

圖2 PEG-2000含量對(duì)紫色紅曲菌TY02的MK代謝影響Fig.2 Effect of PEG-2000 concentration on the MK metabolism of M.purpureus TY02

由圖2可知，在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)加入不同含量的PEG-2000，紫色紅曲菌TY02的MK產(chǎn)量均呈正增長，對(duì)產(chǎn)MK的影響順序?yàn)?0>15>5>20>1>0.5>0 g/L，其中添加10 g/L PEG-2000時(shí)MK產(chǎn)量最高達(dá)845 mg/L，為對(duì)照(81 mg/L)的10.43倍，在發(fā)酵8～16 d，MK產(chǎn)率最高，18 d為拐點(diǎn)，此后，產(chǎn)MK趨向平穩(wěn)，發(fā)酵周期為20～22 d。

2.3 PEG-2000添加時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)TY02生長和MK代謝的影響

在發(fā)酵0、2、4、6、8、10、12 d分別添加PEG-2000 10 g/L進(jìn)行培養(yǎng)，菌體生物量、MK產(chǎn)量與PEG-2000添加時(shí)間的關(guān)系如圖3所示。

圖3 PEG-2000添加時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)紫色紅曲菌TY02生長和MK代謝的影響Fig.3 Effect of PEG-2000 addition time on the growth and MK metabolism of M. purpureus TY02

由圖3可知，在不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)添加PEG-2000，紫色紅曲菌TY02的細(xì)胞生長與MK代謝受到不同程度的影響。與對(duì)照相比，分別在0、2、4、6、8、10、12 d添加，菌體生物量均增加，MK的產(chǎn)量均得到提高，在0 d時(shí)添加PEG-2000時(shí)，生物量和MK產(chǎn)量達(dá)到最大值，此時(shí)生物量為60.62 g/L，MK產(chǎn)量為845 mg/L，分別比對(duì)照增加了81.44%和943.21%，故得到PEG-2000最佳的添加時(shí)間節(jié)點(diǎn)為發(fā)酵初始時(shí)(0 d)。

2.4 PEG-2000對(duì)紫色紅曲菌TY02總MK、胞外MK產(chǎn)量以及胞外MK占比的影響

在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加10 g/L PEG-2000進(jìn)行培養(yǎng)，MK的質(zhì)量濃度、胞外MK占比與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系如圖4所示。

由圖4可知，紫色紅曲菌TY02在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加0、10 g/L的PEG-2000，其MK代謝的總MK與胞外MK的變化趨勢(shì)基本一致，發(fā)酵22 d，其產(chǎn)總MK、胞外MK分別為81、34、845、682 mg/L，后者產(chǎn)總MK、胞外MK分別為前者的10.43、20.06倍；胞外MK占比的代謝趨勢(shì)，前者與后者亦基本上一致，發(fā)酵22 d，分別為41.98%、80.71%，后者為前者的1.92倍。可見發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加10 g/L PEG-2000能大幅提高紫色紅曲菌TY02的MK產(chǎn)量和胞外MK的占比，這與譚海玲[19]研究的紅曲霉產(chǎn)黃色素的發(fā)酵類似。

圖4 PEG-2000對(duì)紫色紅曲菌TY02總MK、胞外MK產(chǎn)量以及胞外MK占比的影響Fig.4 Effect of PEG-2000 on the concentration of total MK, extracellular MK and the proportion of extracellular MK in MK metabolism of M.purpureus TY02

2.5 紫色紅曲菌TY02發(fā)酵過程

在發(fā)酵開始時(shí)(0 d)添加10 g/L PEG-2000進(jìn)行培養(yǎng)，MK的質(zhì)量濃度、pH值、菌絲體生物量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系如圖5所示，整個(gè)發(fā)酵過程，pH先上升，最高至6.91，然后略有下降，至6.6左右時(shí)漸趨平穩(wěn)；當(dāng)pH<6.0時(shí)紫色紅曲菌TY02主要處于生長期，pH>6.0時(shí)則處于MK合成代謝期；當(dāng)發(fā)酵至8 d，菌體合成MK開始加速，10～16 d為MK合成代謝的高峰期，18 d為合成MK的拐點(diǎn)，此后漸趨平穩(wěn)，第22天時(shí)MK達(dá)最高值(845 mg/L)。

圖5 MK的質(zhì)量濃度、pH值、菌體生物量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系Fig.5 Relationship between MK mass concentration, pH,cell biomass and fermentation time

由圖5可知，發(fā)酵至第6天，菌體生物量達(dá)最大值(54.49 g/L)，此后生物量逐漸下降，下降至52.17 g/L時(shí)，即發(fā)酵8 d，MK合成開始加速；生物量處于49.09～45.23 g/L(發(fā)酵10～16 d)，為MK合成的旺盛期；當(dāng)生物量降至42.24 g/L(發(fā)酵18 d)，MK合成出現(xiàn)拐點(diǎn)；當(dāng)生物量降至38.52 g/L(發(fā)酵22 d)，紫色紅曲菌TY02產(chǎn)MK達(dá)最大值(845 mg/L)，從生物量與MK合成的關(guān)系可知，功能紅曲液態(tài)發(fā)酵為典型的次級(jí)代謝，這與童振宇等[20]的研究結(jié)果相符合。

2.6 影響MK代謝重要因素的確定[21]

按Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共進(jìn)行12個(gè)實(shí)驗(yàn)，用Minitab17軟件對(duì)所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及因素效應(yīng)分析見表2和表3。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The Plackett-Burman design matrix and experimental results

表3 因素主效應(yīng)分析Table 3 Analysis sheet of major factor

通過Minitab17對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，擬合一次回歸方程為：

Y=-596+1.356X1+58.33X2-2.88X3+17.8X4+168X5+58.33X6-5.0X7

(2)

其中響應(yīng)值Y為MK的質(zhì)量濃度，模型匯總R-sq為96.92%，這表明，通過一次模型方程得到的響應(yīng)值的可信度達(dá)到96.92%，同時(shí)模型也極顯著(P=0.007<0.01)，說明響應(yīng)值與變量之間存在極顯著的線性關(guān)系。從表3可知，MgSO4·7H2O、NaNO3、PEG-2000的P值分別為0.029、0.010、0.001，影響程度分別為顯著、顯著、極顯著。在本文的研究范圍內(nèi)，上述3個(gè)因子對(duì)MK代謝影響最大，為主效因子，其中PEG-2000的影響達(dá)到極顯著。

2.7 發(fā)酵液的預(yù)處理效果

在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)分別添加0.5、1、5、10、15、20 g/L的PEG-2000進(jìn)行培養(yǎng)，然后按照1.5的方法進(jìn)行發(fā)酵液的預(yù)處理，發(fā)酵液中PEG殘留濃度及預(yù)處理檢測結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵液預(yù)處理后的檢測結(jié)果Table 4 Detection results after pretreatment of fermentation broth

從表4可知，非離子表面活性劑PEG在發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液中的殘留率為87.33%～95.25%，并隨著PEG添加量的增加而逐步上升。添加K4[Fe(CN)6]沉淀PEG，分離后得濾液，濾液中過量的K4[Fe(CN)6]再添加ZnSO4進(jìn)行沉淀，再次分離得濾液，測定濾液中PEG的殘留量為8.14～15.12 mg/L，符合GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，測定預(yù)處理后的濾液中K4[Fe(CN)6]的殘留量為1.91～4.03 mg/L，也符合上述標(biāo)準(zhǔn)的要求。同時(shí)預(yù)處理后的濾液中的MK較處理前提高了4.21%～5.80%，說明預(yù)處理過程沒有對(duì)MK造成損失，反而提高了濾液的純度。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEG對(duì)紫色紅曲菌TY02液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK有重要的影響。分子質(zhì)量為2 000 Da、濃度為10 g/L的聚乙二醇對(duì)紫色紅曲菌TY02的MK代謝影響最大。在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)分別添加0、10 g/L的PEG-2000，紫色紅曲菌TY02產(chǎn)MK、胞外MK占比分別為81 mg/L、41.98%和845 mg/L、80.71%，添加10 g/L PEG-2000組的產(chǎn)MK、胞外MK占比為對(duì)照組的10.43倍、1.92倍。在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選重要影響因子的實(shí)驗(yàn)中，篩選出的主效因子分別為MgSO4·7H2O、NaNO3、PEG-2000，其P值分別為0.029、0.010、0.001，為重要的影響因子，且均為正效應(yīng)，其中PEG-2000對(duì)紫色紅曲菌TY02的MK代謝影響極顯著。采用Minitab17擬合的一次模型方程得到的響應(yīng)值可信度達(dá)到96.92%。PEG-2000作發(fā)酵原料雖符合標(biāo)準(zhǔn)，但因紅曲菌利用PEG較難，且產(chǎn)品中殘留過高含量的PEG亦不利于保健食品的生產(chǎn)。為此，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行了預(yù)處理，預(yù)處理后濾液的相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)。綜上，PEG可大幅提高紫色紅曲菌TY02胞外MK的代謝占比，部分解除了胞內(nèi)代謝物的反饋抑制，從而大幅提高M(jìn)K代謝能力，突破了無甘油液態(tài)發(fā)酵功能紅曲低產(chǎn)MK而無法量產(chǎn)的技術(shù)瓶頸。研究結(jié)果可為非甘油原料的液態(tài)發(fā)酵功能紅曲的量產(chǎn)提供技術(shù)參考，鑒于PEG能夠明顯促進(jìn)紅曲菌MK的代謝合成，因此，從基因表達(dá)和代謝調(diào)控途徑上研究PEG促進(jìn)MK代謝的機(jī)理具有現(xiàn)實(shí)意義。