葡萄酒釀造中降解生物胺乳酸菌的篩選、鑒定及其特性

徐佳敏，周桂珍，田曉菊*

1(寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川，750021) 2(寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川，750021)

生物胺是一類主要存在于發酵食品中具有生物活性的低分子堿性含氮化合物[1]。在食品或葡萄酒發酵過程中，相應的微生物利用前體物質氨基酸脫羧形成生物胺[2-3]。作為許多生物大分子的前體物，適量的生物胺可以提高人體免疫力，有增強血管活性等生理作用[4]。但過量攝入生物胺，可能會對人體產生毒性作用(頭痛、低血壓、心悸、嘔吐)，具體表現取決于個人的敏感性[5-6]。

葡萄酒酒精發酵過程中，存在著甲胺、乙胺、苯乙胺、異戊胺和尸胺等胺類物質[7-8]，但在此發酵過程中，這些生物胺能夠被微生物降解；而在蘋果酸乳酸發酵(malolactic fermentation，MLF)過程中，生物胺主要來源于乳酸菌對葡萄酒中游離氨基酸的脫羧作用[9]。目前，控制發酵食品中生物胺的方式主要為優化生產工藝以及高壓、冷凍等物理方法[10-12]，但這些方法具有一定的局限性，無法控制發酵過程中生成的生物胺。研究發現，如果生物胺已經存在于傳統發酵食品中，或當生物胺的產生基于本地微生物群落時，胺降解菌株的應用將有助于降低這些風險[13-14]。因此，通過接種具有生物胺降解功能的乳酸菌來控制葡萄酒MLF過程中產生的生物胺是有效的手段。而從乳酸菌中篩選出具有生物胺降解菌株，不僅避免了生物胺積累的風險，還可作為發酵劑應用于多種發酵食品中，以及作為益生菌可在人體中發揮益生功能，同時為探究生物胺降解機理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

實驗室自釀葡萄酒、白酒酒醅，寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室保存。

氨基酸：鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸(均為分析純)，上海阿拉丁試劑有限公司。

生物胺標準品：組胺、精胺、亞精胺、尸胺，上海源葉生物科技有限公司；色胺、腐胺、酪胺(純度均≥98%)、丹磺酰氯(純度≥99%)，西格瑪奧德里奇中國公司。

試劑：K2HPO4、KH2PO4、無水乙酸鈉、NaCl(均為分析純)；乙腈、甲醇(均為色譜級)；丙酮(分析純)，天津大茂化學試劑廠。

1.1.2 培養基的制備

MRS培養基(g/L)：蛋白胨 10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉 4.0，葡萄糖 20.0，乙酸鈉 5.0，檸檬酸二銨 2.0，吐溫-80 1.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.04，pH 調至5.5。

生物胺顯色培養基[15](g/L)：MgSO40.4，MnSO40.3，FeSO4·7H2O 0.04，檸檬酸三銨2，CaCO30.1，K2HPO42，5-磷酸吡哆醛2，維生素B10.01，氨基酸(組氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)1，溴甲酚紫 0.06，pH 調至5.5。

以上培養基均121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器與設備

W-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器、BSD-150生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備；PHSJ-3F型 pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；PR224ZH電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；WH-861渦旋振蕩器，太倉市華利達實驗設備有限公司；EX30生物顯微鏡,舜宇光學科技有限公司；5430R高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司；Agilent 1260高效液相色譜儀、C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm )，美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 降生物胺乳酸菌的篩選

1.2.1.1 初篩

分別稱取適量酒醅和葡萄酒酒樣于100 mL無菌生理鹽水中，于37 ℃培養箱中振蕩培養30 min。吸取懸浮液并梯度稀釋至10-6，然后吸取100 μL適宜梯度的稀釋液分別均勻涂布于MRS固體培養基上，37 ℃培養32～48 h，選取乳酸菌相似形態菌株，進行劃線分離并純化，保存。

將純化菌株接種于MRS液體培養基中進行活化，調整菌液濃度為1×108CFU/mL，預先在96孔無菌板中加入1 mL生物胺顯色培養基，吸取100 μL菌液，轉接于96孔無菌培養板中，37 ℃培養48 h后，以不接種的培養基為空白對照，記錄實驗結果。觀察培養基顏色的變化，顯棕紅色或紫色的為陽性(產胺菌)，不變色即黃色為陰性(不產胺菌)，設置3個平行實驗。將陰性菌落挑出，在對應的培養基上劃線分離純化3次，然后于4 ℃保藏備用。

1.2.1.2 復篩

將初篩菌株接于MRS液體培養基中活化2～3代，并調整菌液濃度為108CFU/mL，按接種量2%(體積分數，下同)接種至含6種生物胺的MRS液體培養基中，以不接種菌株的含生物胺MRS液體培養基為空白組。將培養液37 ℃靜置培養24 h。24 h后于10 000 r/min離心5 min取上清液，采用高效液相色譜法測定生物胺含量，并與空白組進行對照，選取降解生物胺種類多且降解能力好的菌株作為生物胺降解菌株。生物胺降解率按公式(1)計算：

(1)

式中：ρ0，對照中生物胺濃度，mg/L;ρ1，反應后生物胺濃度，mg/L。

1.2.2 生物胺含量的測定

1.2.2.1 標準曲線的測定

參考GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》，將質量濃度為1 mg/mL生物胺(尸胺、腐胺、組胺、色胺、精胺、酪胺)標準儲備液用0.1 mol/L鹽酸稀釋定容，配制為100 mg/L的生物胺標準混合使用液。將上述使用液梯度稀釋為2.5、10、15、25、50 mg/L的生物胺系列溶液，按照衍生方法衍生后測定。

1.2.2.2 生物胺降解率的測定

衍生方法參考文獻[16-17]，將含生物胺的菌株培養液8 000 r/min離心5 min，取上清液，精確吸取1 mL待測樣液，依次加入0.2 mL的NaOH溶液(2 mol/L)使反應液呈堿性，0.3 mL的飽和NaHCO3緩沖液，及2 mL丹磺酰氯衍生溶液(10 mg/mL)。漩渦振蕩60 s后置于40 ℃水浴鍋中，避光反應45 min，期間每15 min取出漩渦振蕩60 s，加入100 μL氨水終止反應，并于室溫下避光靜置25 min后用乙腈定容至5 mL，5 500 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜待測。

1.2.2.3 高效液相色譜條件

色譜分離條件參考徐潔[18]的方法，色譜柱為Agilent 5 TC C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A為乙腈，B為超純水，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，流速0.8 mL/min，紫外檢測波長254 nm。洗脫程序如表1所示。

表1 HPLC測定生物胺的洗脫程序Table 1 Elution procedure of biogenic amines by HPLC

1.2.3 降生物胺乳酸菌的鑒定

將活化菌株接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養18 h；4 ℃，8 000 r/min離心10 min獲取菌泥，參照細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取菌株DNA，采用通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)對生物胺降解菌的16S rDNA進行PCR擴增，PCR純化后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，所得序列與NCBI數據庫序列進行比對，以確定菌株種屬。

1.2.4 降生物胺乳酸菌的降解特性研究

1.2.4.1 降生物胺乳酸菌的生長曲線及其產酸能力

將活化兩代的菌液以2%接種量接種至MRS液體培養基中，每2 h測定菌株在600 nm波長下OD值及pH值，設置空白對照組，每組3個平行實驗。

1.2.4.2 降生物胺乳酸菌酸耐受性及降解生物胺能力的測定

將菌株于MRS液體培養基中活化，以2%接種量分別接種于pH為3.5、4、4.5、5的生物胺混合培養基中，37 ℃培養48 h，在600 nm波長下測定其OD值。5 500 r/min離心5 min，取上清液1 mL過0.22 μm濾膜待測。

1.2.4.3 降生物胺乳酸菌乙醇耐受性及降解生物胺能力的測定

將菌株于MRS液體培養基中活化，以2%接種量分別接種于乙醇含量為8%、10%、12%的生物胺混合培養基中，37 ℃培養48 h，在600 nm波長下測定其OD值。5 500 r/min離心5 min，取上清液1 mL過0.22 μm濾膜待測。

2 結果與分析

2.1 生物胺標準品圖譜及標準曲線的制作

采用高效液相色譜法測定6種生物胺，從圖1可以看出，6種生物胺在37 min內得到了很好的分離，并依此確定各生物胺標準品的保留時間。

1-腐胺；2-尸胺；3-組胺；4-酪胺；5-精胺；6-色胺圖1 六種生物胺混合液相色譜圖Fig.1 The mixed liquid chromatogram of six biologenic amines standard

6種生物胺通過高效液相色譜法，以生物胺濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線，回歸方程及相關系數如表2所示，6種生物胺在1～50 mg/L的濃度范圍內線性關系良好，相關系數均>0.99。

表2 六種生物胺回歸方程及相關系數Table 2 Regression equations and R2 of six biogenic amines

2.2 降生物胺乳酸菌的篩選

2.2.1 降生物胺乳酸菌的初篩

通過MRS固體培養基從酒樣與酒醅中共篩選出74株疑似乳酸菌菌株，將其分別接種于生物胺顯色培養基，初步篩選得到19株不產生生物胺(培養基未變色)的菌株，顯色反應結果如圖2所示。

圖2 生物胺顯色反應Fig.2 Color reaction of biogenic amines

2.2.2 降生物胺乳酸菌的復篩

將初篩得到的19株乳酸菌于添加生物胺的MRS液體培養基中培養24 h，測定其生物胺降解率，結果見表3。菌株NXU-Q7、NXU-Q12對5種生物胺均可降解，對腐胺的降解能力差別不明顯。NXU-Q12對組胺和酪胺的降解能力顯著高于NXU-Q7，其在發酵液中對組胺降解率為23.11%，酪胺降解率為16.85%。因此確定NXU-Q12為降生物胺乳酸菌，進行下一步的研究。

2.3 降生物胺乳酸菌的鑒定

2.3.1 形態學鑒定

菌株NXU-Q12在MRS固體培養基上的菌落形態和革蘭氏染色鏡檢結果如圖3所示。菌落呈圓形、表面光滑、邊緣整齊，顏色呈奶黃色。革蘭氏染色結果為藍紫色，為革蘭氏陽性菌。

2.3.2 分子生物學鑒定

將所得到的生物胺降解菌株測序結果通過NCBI中的BLAST進行同源性分析并構建其系統發育樹，如圖4所示。NXU-Q12與序列號為MZ571407.1的植物乳植物桿菌距離較近。因此，結合生物學形態與分子學鑒定可初步確定NXU-Q12為植物乳植物桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)。

表3 不同菌株生物胺降解率的結果Table 3 Degradation rate of biogenic amines by the different strains

a-菌落形態;b-革蘭氏染色光學顯微鏡圖圖3 菌株NXU-Q12的形態學特征Fig.3 Morphological characteristics of NXU-Q12

圖4 菌株NXU-Q12基于16S rRNA基因序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence constructed by NXU-Q12

2.4 降生物胺乳酸菌的降解特性研究

2.4.1 降生物胺乳酸菌的生長曲線及產酸能力

通過測定NXU-Q12在MRS液體培養基中24 h OD值可得到其生長曲線，并同時測定pH值確定其產酸能力。由圖5可知，菌株在0～2 h生長緩慢，在4 h時進入對數生長期，16 h生長趨于穩定狀態；菌株pH值與生長狀態一致，初始階段呈迅速下降后趨于平緩。

圖5 菌株生長曲線和產酸能力Fig.5 Growth curve and acid producing capacity of the strain

2.4.2 降生物胺乳酸菌的耐酸性及其降解生物胺能力

分別在3、3.5、4、4.5、5的pH值條件下對NXU-Q12進行研究，結果如圖6所示。NXU-Q12在不同pH值條件下均能生長，說明菌株具有一定的耐酸能力；但隨著pH值的減小，菌株的生長狀態呈下降趨勢，在pH值為5時，NXU-Q12的生長能力最好。

圖6 酸度對菌株生長的影響Fig.6 Effect of acidity on the growth of strain

不同pH條件下NXU-Q12生物胺的降解能力如表4所示，NXU-Q12在不同pH值對5種生物胺均有降解作用。當pH為4.5時，菌株的生物胺降解率最高，對腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺的降解率分別為27.67%、25.00%、29.44%、27.96%、24.48%；在pH 3和3.5時，菌株降解能力呈下降趨勢，其原因可能是在偏酸環境下菌株雖然具有一定的生長活性，但其氧化酶活性可能受到抑制，從而導致無法有效地降解生物胺[19]。

表4 不同pH條件下菌株生物胺降解能力Table 4 Biogenic amines degradation ability of strains under different pH conditions

2.4.3 降生物胺乳酸菌耐乙醇能力及降解生物胺能力

分別在8%、10%、12%、14%的乙醇濃度條件下對NXU-Q12菌株進行研究，結果如圖7所示。NXU-Q12在乙醇體積分數為10%時生長最好，與其他濃度差異明顯；當乙醇體積分數為10%～14%時，菌株濃度呈下降趨勢，說明菌株活性受到乙醇的影響。其原因可能是當乙醇達到一定濃度時，滲透于微生物細胞膜內，使細胞膜通透性發生改變；而當濃度超過一定范圍后，會使細胞膜滲透壓發生改變，從而使菌株活性降低。

圖7 乙醇體積分數對菌株生長的影響Fig.7 Effect of ethanol content on the growth of strain

不同乙醇條件下NXU-Q12生物胺的降解能力如表5所示，隨著乙醇濃度逐漸升高，菌株生物胺降解率逐漸降低。當乙醇體積分數為10%時，NXU-Q12對5種生物胺的降解率均高于20%；當乙醇體積分數為14%時，NXU-Q12對5種生物胺的降解率均低于11%。在高乙醇濃度條件下，菌株的生長能力降低，胺氧化酶活力降低甚至于失活，從而致使其降解率降低。GARCA-RUIZ等[2]研究發現，隨著乙醇濃度的升高，乳酸菌降解生物胺的能力受到抑制，這與本實驗結果一致。

表5 不同乙醇體積分數下菌株生物胺降解能力Table 5 Biogenic amines degradation ability of strains under different ethanol conditions

3 結論

從葡萄酒酒樣和白酒酒醅中通過生物胺顯色實驗和高效液相色譜法測定，篩選得到可降解生物胺的菌株共7株，以菌株降解生物胺的能力為指標，從中篩選得到1株降解生物胺能力較強的乳酸菌(NXU-Q12)，經形態學和分子生物學鑒定為植物乳植物桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)，并對其生長特性和在不同環境條件下降解生物胺的能力進行研究。結果表明，該菌株在不同的pH和乙醇濃度條件下均可生長且具有降解生物胺的能力，但在pH為3～4.5和乙醇體積分數為10%～14%條件下，其生長活性與降解生物胺的能力同時受到抑制，這也與目前一些研究結果一致[20-21]。通過研究不同環境條件下的菌株生長特性及降解生物胺的能力，對葡萄酒MLF過程中生成的生物胺進行控制具有一定的參考價值。