混菌發酵對昌黎赤霞珠葡萄酒品質的影響

李毅麗，李紅玉，賀艷楠，高山

1(河北化工醫藥職業技術學院 質量檢測與管理系，河北 石家莊，050000)2(中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北 昌黎，066600)3(河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊，050000)

葡萄酒是新鮮葡萄或葡萄汁經發酵后獲得的酒精飲料。發酵過程中，酵母菌可以將葡萄漿果中的糖分解為乙醇、CO2和其他副產物。商業釀酒酵母由于發酵過程易于控制，產品同質性好，在葡萄酒生產中得到了廣泛的應用，但同時導致葡萄酒缺乏典型特征和復雜多樣的風格[1]。而一些天然存在于葡萄中的非釀酒酵母,如伊薩酵母屬、畢赤酵母屬、葡萄汁有孢漢遜酵母屬和德巴利酵母屬等，與釀酒酵母同時參與到葡萄酒的酒精發酵過程中，能夠促進葡萄酒中酯類、醇類等揮發性香氣成分的生成[2-3]，對葡萄酒的色、香、味及產品風格的形成起到至關重要的作用[4]。PRIOR等[5]將Pichiakluyveri和Saccharomycescerevisiae混合接種發酵，葡萄酒中高級醇和乙基酯的含量顯著提高；LIU[6]等將Torulasporadelbrueckii和Schizosaccharomycespombe與S.cerevisiae混合發酵所得葡萄酒品質得以改善。不同酵母株對葡萄酒香氣影響存在差異，在釀酒時需要根據原料和產地選擇合適的釀酒酵母和非釀酒酵母組合[7]。且研究發現，接種比例對于混合釀造工藝的優化起到重要作用[1,8-9]。

河北昌黎是中國干紅葡萄酒的搖籃，是“中國干紅葡萄酒之鄉” “中國釀酒葡萄之鄉”和“中國干紅葡萄酒城”。但近年來，昌黎產區葡萄酒產業缺乏本土特色，產品趨于大眾化，急需研究與原料相匹配的釀造工藝，開發出具有特色的新產品，以滿足廣大消費者對于葡萄酒的不同需求。本研究以河北昌黎產區“赤霞珠”葡萄為原料，利用東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母等2種非釀酒酵母與國產安琪釀酒酵母分別按照不同比例進行混菌發酵試驗，研究葡萄酒品質差異，探究適合的混菌發酵工藝，為國產酵母的應用開辟新的思路，充分發掘昌黎產區“赤霞珠”葡萄酒所特有的產品特色。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：赤霞珠，于2021年10月27日采自河北昌黎產區，總糖含量(以還原糖計)為 195 g/L，可滴定酸含量(以酒石酸計)為6.86 g/L， pH為3.62，衛生狀況良好。

酵母菌株：東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)為河北科技大學飲料酒釀造研究室于 2008年、2009年和2010年分別從河北省昌黎和沙城2個葡萄酒產區的葡萄園土壤、葡萄果表，以及赤霞珠葡萄和龍眼葡萄的自然發酵過程中分離、純化，并保藏的自選酵母菌。安琪酵母(AngelSaccharomycescerevisiae)購于安琪酵母股份有限公司。

試劑：葡萄糖、NaOH、NaCl、重亞硫酸鉀(分析純)，天津市永大化學試劑有限公司；3-辛醇、乙醇、苯乙酮、苯甲醇、乙酸異戊酯(均為色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；果膠酶，煙臺帝伯仕自釀機有限公司；斐林試劑、次甲基藍指示劑、酚酞指示劑等按照GB/T 603—2002進行配制。

1.2 儀器與設備

7820-5975型GC-MS聯用儀，美國安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取手柄，美國Supelco公司；T09-1S恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；DHP-520電熱恒溫培養箱，常州中捷實驗儀器制造有限公司；UV5100型紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；雷磁pHS-3C型pH計，上海儀電儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗處理

對照組：只接種單一安琪釀酒酵母(A)；只接種單一東方伊薩酵母(I)；只接種單一葡萄汁有孢漢遜酵母(H)。

東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母混菌發酵組：東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母3∶1(體積比，下同)同時接種發酵(IA1)；東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母1∶1同時接種發酵(IA2)；東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母1∶3同時接種發酵(IA3)。

葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母混菌發酵組：葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母3∶1同時接種發酵(HA1)；葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母1∶1同時接種發酵(HA2)；葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母1∶3同時接種發酵(HA3)。

酵母的總接種量為 1×106CFU/mL；同時接種指同時加入非釀酒酵母與釀酒酵母進行酒精發酵。

1.3.2 葡萄酒釀造工藝

葡萄采收后經除梗、破碎、混勻后轉入徹底滅菌的10 L玻璃發酵罐，酒樣中加入偏重亞硫酸鉀50 mg/L、果膠酶 30 mg/L，靜置過夜，分別接種1.3.1中所述混合酵母，發酵溫度為25～27 ℃。酒精發酵結束后(殘糖<4 g/L)浸漬24 h，分離得到發酵原酒。之后，采用控溫啟動自然發酵的方式進行蘋果酸-乳酸發酵，結束后加入 50 mg/L SO2終止發酵并滿罐密封貯存，靜置 1 個月，分離沉淀并裝瓶于恒溫地下酒窖瓶儲，陳釀 3 個月后對各發酵組取樣進行理化指標分析、揮發性香氣成分測定、香氣感官評價。

1.3.3 理化指標檢測

葡萄和葡萄酒中總糖、酒精度等理化指標的測定參考 GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.4 揮發性成分測定萃取

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對葡萄酒香氣成分進行檢測，參考毛建利等[10]的方法，略作改動。

前處理：稱取2 g NaCl，準確移取5 mL酒樣，0.5 mL質量濃度為0.3 g/L的內標物3-辛醇，依次放入20 mL頂空瓶中；磁力攪拌器轉速1 000 r/min，50 ℃水浴平衡15 min，萃取吸附30 min，進樣口250 ℃解吸3 min。

色譜條件：Agilent J&W HP-INNOWAX 色譜柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm)；載氣He(99.999%)，流速1.0 mL/min；升溫程序：40 ℃保持12 min，以10 ℃/min的速率升至120 ℃保持12 min，再以3 ℃/min升至250 ℃保持5 min；進樣口溫度250 ℃。MS條件：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子電離源，電子能量70 eV；質量掃描范圍45～550 u。

揮發性物質的定性：提取揮發性成分質譜圖，通過NIST質譜數據庫進行，并根據C8-C20烷烴混合標準品的保留時間，用保留指數(retention index，RI)法對揮發性物質進行定性。

揮發性物質的定量[11]：選用內標半定量法，通過內標物的峰面積與樣品中各組分的峰面積比值，計算各化合物的相對濃度，按照公式(1)計算：

(1)

式中：c1，待測化合物的質量濃度，μg/mL；f，相對校正因子，f=1；A1，待測化合物的峰面積；A0，內標物(3-辛醇)的峰面積；c0，加入內標(3-辛醇)的質量濃度，μg/mL；V0，加入內標(3-辛醇)的體積，mL；V1，萃取的5 mL稀釋酒樣的體積，mL。

1.3.5 香氣活性值計算及氣味特征分類

香氣活性值(odour activity value，OAV)由物質含量除以其嗅覺閾值得到。葡萄酒中香氣物質按照其氣味特征可分為9組，分別為：果香、花香、植物味、堅果香、焦糖味、土腥味、化學味、脂肪味、烘烤味[1]，對所有OAV>0.1的香氣物質進行分組，各組物質OAV的總和表示葡萄酒中該類香氣的輪廓特征。

1.3.6 葡萄酒感官評價

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用的分析方法》。由經過葡萄酒專業品評培訓的10名工作者組成評定小組，對產品的外觀、香氣、滋味、典型性進行綜合評分，其中，外觀滿分20分，香氣滿分30分，滋味滿分40分，典型性10分，總分100分。去掉1個最高分和1個最低分，然后取平均值即為產品感官品評得分。

1.3.7 數據統計分析

所有樣品均分別平行測定3次取平均值。實驗數據通過Excel 2019、SPSS 17.0、Origin 2018進行匯總與統計分析。

2 結果與分析

2.1 發酵過程分析

在葡萄酒發酵過程中，發酵體系中的糖一部分轉化為酵母菌自身代謝所需的能量，另一部分轉化為酒精和CO2。通過監測發酵過程中糖分、酒精和CO2排放量可驗證酵母發酵能力[12]。

由圖1可知，9組樣品在接種120 h后完成發酵。發酵反應趨勢基本一致，但反應速率存在一定差異。樣品A在反應初期反應速率逐步提高，在48～72 h時達到最大值。與之相比，I、IA1、IA2、IA3在24～48 h內糖分下降最快，同時迅速生成乙醇和CO2，CO2生成速度在48～72 h達到最大值；H、HA1、HA2、HA3在0～24 h內糖分下降最快，卻在24～72 h迅速生成酒精和CO2。與安琪釀酒酵母相比，東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母在發酵早期迅速生長繁殖，使得發酵過程提前啟動，但葡萄汁有孢漢遜酵母適應期較長，需要消耗大量的還原糖提供代謝所需能量，東方伊薩酵母能夠更迅速地將還原糖轉化為酒精和CO2。

a-還原糖含量;b-每24 h樣品中還原糖含量的減少量;c-酒精度;d-每24 h樣品中酒精度的增加; e-CO2排放量;f-每24 h樣品中CO2排放量的增加量圖1 發酵過程曲線Fig.1 Fermentation process curve

2.2 香氣成分分析

葡萄酒香氣由品種香氣、發酵香氣和陳釀香氣組成[13]。所使用的酵母類型和接種比例不同，使得葡萄酒產生的揮發性化合物在組成和含量上產生很大差異[14-15]。

對赤霞珠葡萄汁(SC)組及實驗組樣品進行香氣成分分析，結果詳見電子增強出版附表(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032629)，并結合圖2進行分析。酒樣中共檢測出揮發性香氣成分117種，其中品種香氣成分9種，包括萜烯類4種、降異戊二烯衍生物類3種、揮發性酚類1種、C6化合物1種。發酵香氣成分中，含酯類 36種、高級醇18種、酸類8種、醛類8種、酮類8種、酚類和烯炔類4種、其它化合物24種。如圖2所示，酒樣中高級醇含量較為突出，其次是酯類和酸類，使得產品呈現復雜的香氣。在樣品A中檢出32種揮發性化合物，總含量為39.44 mg/L，IA3中檢出種類最多為55種，總含量為48.87 mg/L，IA1檢出48種，總含量為66.48 mg/L，為最高值，比A增加了40.67%。東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母參與發酵過程，使得樣品中揮發性香氣成分種類和含量得到不同程度的提高，并且非釀酒酵母比例越高，提高越顯著。

2.2.1 品種香氣成分組分比較

混合發酵體系的高糖苷酶活性有利于增加葡萄酒的品種香氣組分和香氣復雜度。其中，葡萄汁有孢漢遜酵母在發酵環境中具有最高的β-葡萄糖苷酶活性，促使糖苷結合態香氣物質(如單萜烯、降異戊二烯和芳香族化合物)在糖苷酶作用下被釋放，具有了揮發性。由附表可知， HA1樣品中品種香氣成分為5種，含量為1.58 mg/L，證明了葡萄汁有孢漢遜酵母具有增加品種香的優勢。IA3樣品中品種香氣成分種類達6種，含量為1.52 mg/L，僅次于HA1，說明東方伊薩酵母同樣具有增加品種香的性能。

2.2.2 酯類組分比較

酯類化合物是葡萄酒乙醇發酵的典型副產物，主要形成于發酵和陳釀過程，大多數酯類物質具有鮮花或水果的香氣[16]。本研究中的發酵酒樣酯類成分最高為19種，相比釀酒酵母單獨發酵，非釀酒酵母參與發酵可顯著促進酯類成分的復雜性[17]。發酵酒樣HA2中含量最多，為10.54 mg/L，比A樣品增加了30.77%，占其全部香氣成分的20.65%。證明葡萄汁有孢漢遜酵母可以顯著增加葡萄酒內酯類物質的含量。另外，根據實驗結果發現，東方伊薩酵母參與發酵同樣能夠提高酯類的含量和種類。

酒樣中共有且含量較高的酯類成分是乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯。與樣品A相比，IA3的乙酸乙酯含量增加27.51%，IA2的辛酸乙酯含量增加34.93%，IA2的癸酸乙酯含量增加200.83%。在酒樣中還有乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯等共有的酯類。乙酸異戊酯具有較強的新鮮果香，可賦予葡萄酒香蕉、梨、蘋果的酸甜味。乙酸苯乙酯是一種特殊的芳香化合物，當含量超過 0.25 mg/L 時，能夠給葡萄酒增添玫瑰等花香[16]。由附表可知葡萄汁有孢漢遜酵母能夠顯著增加葡萄酒中的乙酸異戊酯與乙酸苯乙酯的含量，與前人研究結果一致[18-19]。

2.2.3 高級醇組分比較

醇類物質主要是酵母酒精發酵過程中氨基酸或糖代謝的產物，是葡萄酒發酵香氣的重要成分。含量低于 300 mg/L 時，醇類能使葡萄酒的香氣更為復雜、濃郁；但當其總含量超過 400 mg/L 時，就會給人帶來強烈的刺鼻味和不悅感[16]。由實驗結果可知，發酵酒樣醇類總含量為16.05～47.54 mg/L，低于300 mg/L，能夠賦予酒樣豐富的香味。樣品IA1中醇類種類與含量均為最高值，含量與A樣品相比增加了93.96%，占其全部香氣成分的71.51%。

在酒樣中共有的含量最為突出的醇類物質為苯乙醇，含量達15.65～42.55 mg/L，是各酒樣中最為典型的醇類成分。苯乙醇賦予葡萄酒蜂蜜、玫瑰、丁香花等宜人香味，樣品A中苯乙醇含量為23.98 mg/L，低于大部分酒樣，說明混合發酵可促進苯乙醇的生成。樣品IA1中含量為33.51 mg/L，僅次于樣品H，比樣品A增加了34.15%。

2.2.4 酸類組分比較

葡萄酒中的有機酸能夠保持酒體平衡和口感清爽特性，適宜的含酸量能使葡萄酒帶有新鮮的水果香，修飾葡萄酒的滋味和口感，并且有利于形成瓶貯酒香。酸類物質主要來源于發酵副產物和葡萄漿果。發酵樣品中共檢測出8種酸類物質，樣品IA1中含有7種，A中僅含4種。酸類物質總含量為2.92～5.43 mg/L，IA1中含量最高，比樣品A增加了85.96%，占其全部香氣成分的8.17%。樣品中共有的酸類組分有己酸、辛酸、癸酸，HA1中己酸為0.66 mg/L，IA1中癸酸含量為1.28 mg/L，均為最高值。

為了更好地區別不同酒樣中揮發性香氣成分的差異，對所有OAV>0.1的36種揮發性香氣成分及9組酒樣進行主成分分析，結果如圖3所示。前3個主成分分別占數據總體方差的35.9%、16.9%和13.9%，總貢獻率為66.7%。由于接種菌株及接種比例的不同，各試驗組有著不同的分布，葡萄汁樣品CS組位于PC1、PC2的正方向上，主要含有香葉基丙酮、3-丙酮、己二酸二異丁酯、β-紫羅蘭酮等香氣成分；樣品A主要位于PC1和PC2的正方向上，與H、HA1、HA2、HA3及IA3較為接近，酒樣中乙酸乙酯、丁酸乙酯、正辛醇、乙酸異戊酯等香氣成分含量豐富；IA1位于PC1和PC3的正方向和PC2的負方向上，與其它組別相距較遠，正庚醇、異戊醇等香氣成分含量較為突出；I和IA2位于PC2和PC3的負方向上，癸酸乙酯、1-癸醇等含量較為豐富。由此可見，東方伊薩酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪酵母混合發酵，對發酵酒樣中香氣成分影響較大。

a-得分圖;b-載荷圖圖3 發酵結束后酒樣中OAV>0.1的香氣化合物主成分分析Fig.3 Principal component analysis for aroma compounds (OAV>0.1) in wines after alcoholic fermentation

對酒樣中OAV>0.1的物質進行香氣分組，選取∑OAV>0.5的7 種香氣類型繪制得到葡萄酒的香氣輪廓圖。如圖4所示，所有發酵酒樣的香氣均以果香和花香為主，其次為植物味、堅果香、焦糖味、化學味、脂肪味。相較于樣品A，IA1、IA2、HA2中果香和花香顯著提高[20]。這與混合發酵顯著提高了樣品中酯類、醇類等物質含量有關。植物味、脂肪味及化學味在低濃度條件有利于提升香氣復雜度，所有處理無顯著差別。

a-樣品I、IA1、IA2、IA3和A;b-樣品H、HA1、HA2、HA3和A圖4 赤霞珠干紅葡萄酒感官香氣輪廓圖Fig.4 Sensory aroma profile of Cabernet Sauvignon dry red wine

2.3 感官品評結果

由感官品評結果可知，樣品IA1綜合評分最高，為89.5，該酒樣澄清度較好，呈新酒所具有的紫紅色；酒體香氣優雅細膩，具有赤霞珠葡萄品種的香氣特性，具有濃郁的發酵香氣，但協調性略差，還需要在后續陳釀過程中增加陳釀香氣，形成更加協調豐富的香氣；酒體豐滿濃郁，平衡協調性較好，隨著陳釀過程的進行，還需逐漸增加葡萄酒的質感。與A樣品相比，其他樣品在香氣和滋味濃郁度、復雜性等均有所改善。

3 結論

東方伊薩酵母與安琪酵母混合發酵能夠更迅速地將還原糖轉化為乙醇和CO2，并顯著促進揮發性香氣成分的形成。二者以3∶1的比例混合發酵時，揮發性香氣成分多達48種，含量比安琪酵母單獨發酵酒樣增加68.56%；其中品種香氣成分4種，發酵香氣成分酯類15種、高級醇10種、酸類7種，發酵香氣成分含量與安琪酵母單獨發酵酒樣相比分別增加了18.98%、93.96%和85.96%，占其全部香氣成分的14.43%、71.51%和8.17%；酒樣中苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等香氣成分的含量得到不同程度的增加，增強了葡萄酒中的花香和果香；經感官評定，該樣品評分最高，為89.5。因此，可將東方伊薩酵母與安琪酵母以3∶1的比例混合發酵作為昌黎產區赤霞珠葡萄酒理想的混菌發酵方案?；炀l酵可改善葡萄酒發酵過程，提高葡萄酒風味的復雜性，研究結果為生產昌黎產區獨特風味的葡萄酒產品提供了參考。