大豆脂肪氧合酶的粗提取及其強化乳香風味的研究

高雨婷，錢建瑛，史勁松，閆建國，許正宏*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 藥學院，江蘇 無錫，214122) 3(寧夏塞尚乳業有限公司，寧夏 銀川，750001)

奶業是健康中國、強壯民族不可或缺的產業，牛奶中含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素和礦物質等營養物質，營養全面且易于人體吸收[1]。乳制品的風味是影響其質量的重要因素[2-3]，乳脂肪對奶制品的風味形成具有重大作用[4]，但隨著消費者對健康意識的提高，更傾向于購買低脂或脫脂乳制品，降低攝入過多乳脂肪帶來的健康風險[5]。但脫脂乳存在口感不濃厚，風味不突出等缺點。因此，迫切需求采取新的加工技術來強化乳香風味的形成，獲得風味濃郁、可用于調配使用的天然風味乳脂基料，既滿足消費者的感官享受，又滿足了其對健康的需求。

利用酶解法酶解奶油獲得風味成分增強的奶香基底是目前的研究熱點，酶可將乳脂肪分解成為脂肪酸、甲基酮及內酯類物質[6]，將其調配到不同的乳制品中，可提升乳制品的獨特風味。目前的研究集中于利用脂肪酶對黃油、淡奶油等底物進行酶解，但酶解過后產物具有令人不適的酸味，需要后期進行調配。

脂肪氧合酶 (lipoxygenase，LOX)是一種含非血紅素鐵的加氧酶，專一催化具有順，順-1，4戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸及其相應的脂，形成具有共軛雙鍵的脂氫過氧化物，再經過進一步的反應生成各種揮發性的脂類物質。LOX的活性部位含有鐵離子，酶促反應時，首先氫原子從底物上離開，同時鐵離子被還原。第二步為分子氧與底物自由基反應，形成過氧化自由基；最后，過氧化自由基被LOX的鐵所還原，生成氫過氧化合物，而LOX的鐵轉變為Fe3+。含有順，順-1，4戊二烯結構的不飽和脂肪酸、脂肪酸酯都可以作為LOX的底物。植物中其天然底物主要是亞油酸和亞麻酸，動物體內其天然底物主要是花生四烯酸。LOX的來源不同或者底物不同，都會導致其加氧的位置不同，形成的底物也就有所差異。目前已研究發現2種大豆脂肪氧合酶同工酶LOX-1和LOX-2。LOX-1的底物為不飽和脂肪酸，生成13-氫過氧化物；LOX-2的底物為酯化底物，生成9-氫過氧化物或3-氫過氧化物[7]。

張嬋等[8]利用LOX處理香菇，1-辛烯-3-醇、3-辛酮等特征風味物質含量顯著增加，得到了香菇風味增強的濃縮液。LOX也可與過氧化氫酶等協同作用，增強水果和蔬菜的自然香氣，例如黃瓜風味中的風味化合物2-反式己烯醛和2-反式-6-順式壬二烯醛，就是亞麻酸的酶促氧化分解產物[9]。KERLER 等[10]利用LOX催化水解后的紅花油和亞麻籽油合成氫過氧化物，氫過氧化物經氫過氧化物裂解酶裂解產生己醛，總產率為50%。LOX催化生成的氫過氧化物分解后會產生六碳醇與醛，其具有青草芬芳的自然風味，會給人帶來一種食品新鮮的感覺[11]。

本實驗采用LOX粗酶對底物黃油進行酶解，探究LOX對強化乳香風味成分效果的影響，獲得風味濃郁的天然、安全乳脂基料，同時進一步拓寬大豆LOX的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安佳原味黃油，恒天然商貿有限公司；黃大豆，上海裕田農業科技有限公司；吐溫-20、硼酸、NaOH、亞油酸、冰醋酸、甲醇、二甲基亞砜，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

磁力攪拌器，艾卡儀器設備有限公司；水浴鍋，太倉市強樂實驗設備有限公司；電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；GC-MS-QP 2010 Ultra，日本島津；紫外分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆LOX粗提取

大豆經攪拌器打碎，用40目標準篩去皮。稱取10 g豆粉，分別加入50、100、150 mL冰水[料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15，(g∶mL)]攪拌浸提0.5、1、2、3 h后，于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，上清液即為大豆LOX粗酶液。

1.3.2 酶活力的測定

將0.25 mL吐溫-20分散于10 mL 0.2 mol/L pH 9.0硼酸鹽緩沖液，搖動、逐滴加入0.27 mL亞油酸，充分混合，加入1.0 mL 1 mol/L NaOH溶液至澄清，調pH至9.0，緩沖液稀釋至500 mL作為底物液。

取0.1 mL粗酶液移入0.2 mL底物和2.7 mL緩沖液中，混勻，25 ℃水浴3 min后，于100 ℃水浴5 min終止反應，于234 nm測吸光度；空白對照為0.1 mL滅活酶、0.2 mL底物和2.7 mL緩沖液于25 ℃水浴3 min。

酶活力定義為：25 ℃、pH 9.0，以亞油酸為底物的3 mL反應體系，于234 nm處每分鐘增加0.001吸光度值定義為1個酶活力單位[12]。

1.3.3 粗酶酶學性質測定

1.3.3.1 溫度對酶活力的影響

改變1.3.2中酶活力測定時的水浴溫度，測定LOX粗酶在不同反應溫度(20～60 ℃)下的酶活力。

1.3.3.2 pH對酶活力的影響

改變1.3.2中酶活力測定時反應體系的pH值，分別用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 3～5)、硼酸-硼酸鈉(pH 6～11)緩沖液，測定LOX粗酶在不同pH下的酶活力。

1.3.3.3 金屬離子對酶活力的影響

在底物中分別添加終濃度為0.1和1 mol/L的一價金屬離子(Na+、K+)、二價金屬離子(Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+)，測定添加金屬離子后LOX粗酶的酶活力，以未添加金屬離子的酶活力為100%。

1.3.3.4 底物促溶劑對酶活力的影響

在緩沖液中分別添加體積分數為2%和6%的甲醇、二甲基亞砜促進底物在緩沖液內分散，測定添加底物促溶劑后LOX粗酶的酶活力，以未添加促溶劑的酶活力為100%。

1.3.4 LOX酶解對風味的影響

取50 mL黃油加入LOX粗酶5 mL，磁力攪拌混勻，40 ℃反應1 h后，90 ℃水浴10 min滅酶，于室溫下6 000 r/min離心10 min，取上層油相為產物進行揮發性成分分析和感官評價。

1.3.5 酶解溫度對風味的影響

取50 mL黃油加入LOX粗酶5 mL，磁力攪拌混勻，分別于35、40、45和50 ℃反應1 h后，90 ℃水浴10 min滅酶，于室溫下6 000 r/min離心10 min，取上層油相為產物進行揮發性成分分析和感官評價。

1.3.6 酶解時間對風味的影響

取50 mL黃油加入LOX粗酶5 mL，磁力攪拌混勻，分別于40 ℃反應1、2、3 h后，90 ℃水浴10 min滅酶，于室溫下6 000 r/min離心10 min，取上層油相為產物進行揮發性成分分析和感官評價。

1.3.7 揮發性成分分析

采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)方法，取5 mL樣品，加入10 μL 50 mg/L 4-甲基-2-戊酮作為內標，置于20 mL頂空瓶中，將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數據。

GC-MS的分析條件：采用DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為He，流速1.6 mL/min。色譜柱起始柱溫50 ℃(保持1 min)，以8 ℃/min升到230 ℃保持5 min。進樣口溫度250 ℃。

質譜條件為電子轟擊離子源，離子源溫度200 ℃，檢測電壓1 000 V，界面溫度250 ℃，發射電流100 mA，電子能量70 eV。

1.3.8 感官評價

由10名人員組成感官評價小組，根據各自的喜好對酶解產物的香氣進行奶香味、持續感、醇厚味、異味、整體接受性5個方面進行評價，滿分10分，具體的評分標準見表1。

表1 香氣評分標準Table 1 Sensory evaluation criteria

2 結果與分析

2.1 LOX粗酶提取條件的優化

料液比對LOX粗酶酶活力的影響如圖1-a所示，料液比增加，酶活力呈現先上升后降低的趨勢，最佳料液比為1∶10(g∶mL)。提取時間對LOX粗酶酶活力的影響如圖1-b所示，隨著提取時間增加，酶活力呈現先升高后降低的趨勢，最佳提取時間為1 h，可能是由于在提取前期，提取時間越長，酶的溶出量越多，但隨著時間不斷增加，細胞內其他雜質混入提取液，影響了酶的溶出以及活力[13]。

a-料液比；b-提取時間圖1 料液比和提取時間對酶活力的影響Fig.1 Effects of liquid ratio and extraction time on enzyme activity

2.2 LOX粗酶的酶學特性

對不同溫度下LOX的酶活力進行分析，測得酶活力如圖2-a所示，低溫下LOX粗酶的酶活能保持較高水平，溫度在30～40 ℃時酶活較為穩定，溫度達到40 ℃時，酶活力達到最大，溫度繼續升高，酶活力下降明顯，可能是由于溫度高導致LOX部分失活。

考察pH對酶活力的影響，測定不同pH下LOX的酶活力如圖2-b所示。酶活力呈現出先升高再降低的趨勢，當pH達到7時酶活力達到最大。大豆LOX具有較寬的pH穩定范圍，在本實驗中，pH<6時酶活力出現下降，但仍具有活力，部分原因是其底物亞油酸在pH<7時溶解性較差，導致酶活力降低[14]。

研究金屬離子對酶活力的影響，結果如圖2-c所示。0.1 mol/L的Na+、K+、Mg2+對酶活力有激活作用，1.0 mol/L的K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+對酶活力有明顯的抑制作用。有些金屬離子會在酶與底物之間形成一種酶-金屬離子-底物的三元復合物，有利于底物與酶的活性中心結合[15]，從而對酶活力有提高的作用。

底物的溶解度可以影響酶和底物結合，研究促溶劑對酶活力的影響，結果如圖2-d所示。添加體積分數為2%的甲醇、二甲基亞砜對酶活力有提升作用，原因可能是促進了底物的溶解[16]。體積分數為6%時，酶活力受到了抑制，可能是高濃度的有機溶劑使部分酶失活所致。

2.3 LOX酶解對風味的影響

實驗前期對黃油的風味進行了分析，共檢測出40種主要揮發性成分(表2)，其中對風味貢獻最大的是酸類物質，如己酸、辛酸、正癸酸等這些飽和脂肪酸[17]，它們是構成乳香的重要成分。醛類化合物的含量雖然不高，但風味閾值較低，因而在奶香味形成中起著重要的作用[18]，如2, 4-壬二烯醛、壬醛等，具有加熱奶油的風味。

a-溫度；b-pH；c-離子種類；d-促溶劑種類圖2 不同條件對酶活力的影響Fig.2 Effects of temperature, pH, metal ions and additive agents on enzyme activity

利用LOX粗酶酶解黃油后，主要揮發性成分增加到48種，飽和脂肪酸含量增加，尤其是己酸、辛酸、丁酸含量明顯增加；醛類物質含量略有降低；酮類物質含量顯著增加，如2-壬酮，并且產生了2-庚酮，這些酮類物質的前體來源于乳脂肪中的脂肪酸，在LOX的作用下經過一系列的氧化分解而形成。酮類物質尤其是甲基酮類多被描述為清新的奶油香氣，并且具有較高的香氣強度，是形成乳制品風味的重要組成成分[19]；另外，酶解后δ-癸內酯、丁位己內酯等酯類化合物含量顯著增加，酯類雖然含量不高，但對乳中奶香的形成貢獻也很大[20]。其中內酯類物質多被描述為奶香柔軟、綿長的感覺；一些脂肪酸乙酯類具有水果的甜香味，可以緩和酸類所帶來的刺激性味道，使奶香更加協調、柔和。

表2 黃油酶解前后主要揮發性成分及含量Table 2 Compositions and contents of main volatile components of butter before and after enzymatic hydrolysis

續表2

2.4 酶解溫度對風味的影響

酶解產物中的揮發性成分隨著酶解溫度的升高而發生改變。不同酶解溫度下酸類、醛類、酮類、酯類物質含量如圖3-a和圖4所示。在35～50 ℃時，隨著酶解溫度的升高，酸類化合物含量明顯增加；醛類、酮類、酯類物質的變化范圍相對不明顯。在高溫下，可能會發生如乳脂的氧化、乳蛋白的變性以及乳糖和氨基酸之間的美拉德反應等一系列副反應[21]。另外溫度過高可能會導致一些成分揮發，并且酸類物質含量過高會產生酸敗氣味。不同酶解溫度下產物的感官評分如圖5所示，酶解溫度為40 ℃時感官評價較好，因此認為40 ℃是LOX酶解黃油強化風味的適宜溫度。

2.5 酶解時間對風味的影響

不同酶解時間下揮發性成分的含量如圖3-b和圖4所示，感官評分如圖5所示。酶解產物中的揮發性成分的總量在1～3 h不斷增加，其中酸類物質含量增加明顯，醛類、酮類、酯類物質的變化范圍相對不明顯。酶解時間過長也會導致酶解體系酸含量過高，產生酸敗風味，1 h時感官評價較好，因此認為1 h是LOX酶解黃油強化風味的適宜溫度。

a-酶解溫度；b-酶解時間圖3 酶解溫度和時間對風味的影響Fig.3 Effects of temperature and reaction time on flavor

圖4 不同酶解產物中揮發性成分熱圖Fig.4 Heat map of volatile components of different enzymatic hydrolysis products

GC-MS數據的主成分分析(principal component analysis，PCA)結果如圖6所示，第一主成分(PC1)的貢獻率為59.7%，第二主成分(PC2)的貢獻率為15.1%，LOX酶解黃油前后樣品分離明顯。將滅活后的LOX粗酶與黃油在40 ℃反應1 h，其結果與黃油、酶解后、LOX粗酶樣品均具有明顯差異，基本可以排除大豆LOX粗酶本身帶來的風味影響。

圖6 不同酶解產物的揮發性成分主成分分析Fig.6 Principal component analysis of volatile components of different enzymatic hydrolysis products

3 結論

從市售大豆中提取LOX粗酶并研究其酶學性質，發現LOX粗酶的最適反應溫度為40 ℃，最適反應pH為7.0。采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用方法，對LOX粗酶酶解黃油后產物中的揮發性成分進行檢測分析，揮發性成分達到48種，己酸、辛酸、丁酸、2-壬酮、2-庚酮、δ-癸內酯、丁位己內酯等成分含量顯著增加，這些是形成乳制品風味的重要組成成分。酶解的溫度、時間等因素條件對LOX酶解后的揮發性成分有一定影響，結合GC-MS數據及感官評價結果，最終確定增強乳香的酶解工藝條件為溫度40 ℃，酶解時間1 h。酶解后的產物奶香濃郁柔和、香氣協調性好、整體接受性高，可作為天然的奶味香精在乳制品中應用。