熱處理對駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成與含量的影響

明亮，那琴，吳曉云，吉日木圖*

1(內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特，010018) 2(內蒙古駱駝研究院，內蒙古 巴丹吉林，737300)

動物乳具有較高的營養價值，能提供大量對人體有益的物質，如蛋白質、鈣、維生素和礦物質等[1]。其中，乳蛋白質是動物乳中的主要營養成分，其氨基酸含量和構成比例基本同人體蛋白合成時所需要的數量、比例接近[2]。乳中氨基酸是構成乳蛋白大分子的基礎物質，能夠維持機體組織生長更新、參與多種化學反應、提供生理活動所需熱能，并具有抗癌、降低膽固醇、強化免疫、抑制脂肪沉積及抗糖尿病等功能[3]。評價食品中營養價值的一項重要指標就是食品中氨基酸含量與種類是否豐富與齊全。從動物乳產品的多樣化、安全性和貨架期等方面考慮，生產廠家會對原料乳進行不同程度的熱處理，使其符合相關的衛生標準，同時保證產品質量穩定。原料乳在不同的加熱過程中會發生一系列的理化反應，導致蛋白質和脂肪的解離，破壞了原有的結構，形成一些新的游離物質會造成體系不穩定、營養成分流失等[4]。

牛乳是目前乳及乳制品最主要的來源，也是人類利用率最高的動物乳，占乳制品消費量的95%[5]。牛乳主要由水、蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質等組成，是人們膳食結構的重要組成部分，也為人體提供必需營養物質。山羊乳的基本營養成分與牛乳類似[6]，其酪蛋白的組成更接近人乳，β-乳球蛋白的含量較低(相比牛乳低50%)，不易發生致敏反應[7]；此外，羊乳脂肪球顆粒直徑小，更容易被人體消化吸收[8]。被譽為“沙漠白金”的駝乳不含β-乳球蛋白，富含胰島素和類胰島素生長因子、不飽和脂肪酸等，具有極高的營養價值[9]；此外，駝乳含有乳鐵蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶和維生素C等功效因子，具有一定的醫療保健作用[10-11]。熱處理是原料乳及其乳制品加工保存最主要的方法。近年，隨著人們對非牛乳營養、藥用保健價值的研究興趣逐漸增加，駝乳、羊乳及其乳制品的開發利用也迅速發展。然而，熱處理條件對駝乳、牛乳和山羊乳中營養成分的影響至今還未得到科學、系統地研究。

目前，HPLC[12]和氨基酸分析儀[13]是檢測食品中氨基酸的重要方法。HPLC與氨基酸分析儀法相比，具有檢測限與靈敏度高、衍生化產物穩定、重復性好、簡便可靠等優點[14]。然而，動物乳氨基酸組成的研究主要采用氨基酸分析儀[15-17]，基于HPLC的駝乳、牛乳和山羊乳氨基酸組成的分析極為有限[18]；且常見乳源(駝乳、牛乳和山羊乳)氨基酸組成與熱處理條件的關系并不清楚。因此，本研究分別收集駝乳、牛乳和山羊乳樣本，采用HPLC法對不同熱處理條件下的3種乳進行氨基酸組成的檢測和比較分析，進而解析乳中氨基酸的組成與熱處理程度的關系，以期為不同熱處理條件下的乳中氨基酸的進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 乳樣的采集及處理

本研究所用到的駝乳、牛乳和山羊乳均采自內蒙古阿拉善左旗一牧場。采集后迅速用冰袋保存，運輸至實驗室。對駝乳、牛乳和山羊乳分別進行低溫長時巴氏殺菌[(low temperature long time，LTLT)65 ℃、30 min]、高溫短時殺菌[(high temperature short time，HTST)85 ℃、15 s]和超高溫瞬時滅菌[(ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT)135 ℃、5 s]處理；同時設一組未處理組(對3種畜乳不做任何處理)。分別將不同熱處理過的乳樣和未處理的樣本在-20 ℃冷凍保存，備用。

1.2 實驗材料

甲醇、乙腈(均為色譜純)，美國Fisher Scientific公司；Na2B4O7·10H2O、Na2HPO4·12H2O、磷酸(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸(優級純)，北京化工廠；移液器及吸液頭，德國Eppendorf公司；水解管，pyrex，產品貨號：60827-023 13 mm×100 mm；17種氨基酸混合標準品(純度≥99%)、氨基酸衍生化試劑盒，日本島津公司。

1.3 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜系統、Lab Solution色譜工作站、RF20A熒光檢測器，日本島津公司；DHG-9123A型鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；BS210S型電子天平，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；vortex zx3漩渦振蕩器，美國SI公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品處理

取3 mL的乳樣于水解管中，加入等體積的6 mol/L鹽酸，滴入新蒸餾的苯酚4滴，溶解；并充入高純N22～3 min，反復置換3次后，在充N2狀態下封口。將水解管置于(120±3) ℃的恒溫干燥箱中，水解22～24 h。取出水解管，冷卻至室溫，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉移至容量瓶中，用1 mol/L的鹽酸定容。再用0.45 μm尼龍濾膜過濾，準確吸取濾液于瓶中，在40～50 ℃真空干燥器中干燥，干燥后的殘留物用去離子水溶解，再干燥，反復進行2次，最后蒸干。

1.4.2 流動相的配制

流動相A：Na2HPO4·12H2O 9.0 g， Na2B4O7·10H2O 9.5 g，加水2 000 mL，用36%鹽酸(約3 mL)調pH至8.2，用0.45 μm濾膜過濾。流動相B：甲醇450 mL，乙腈450 mL，水100 mL，混勻，超聲脫氣。

1.4.3 衍生用樣品溶液的配制

準確量取樣品溶液500 μL，置于2 mL樣品瓶中，準確加入內標溶液50 μL混勻，作為衍生用樣品溶液。取鄰苯二甲醛(phthalaldehyde reagent,OPA)衍生試劑A液1支，加入OPA衍生試劑B液60 μL混勻；作為OPA衍生試劑。

1.4.4 衍生用混合氨基酸標準溶液

準確量取氨基酸分析方法組件包中的氨基酸標準溶液100 μL，置于2 mL樣品瓶中，準確加入內標溶液50 μL、0.1 mol/L鹽酸400 μL，混勻，作為衍生用混合氨基酸標準溶液(表1)。

表1 氨基酸標準物質濃度Table 1 Concentration of amino acid standards

1.4.5 色譜條件

色譜柱：島津AJS-01氨基酸專用分析柱(C18，3 μm，4.6 mm×150 mm)；RF檢測器激發波長340 nm，發射波長450 nm，柱溫50 ℃。流動相A的梯度變化為：0～6 min(95%～90%)，6～8 min(90%)，8～10 min(90%～84%)，10～23 min(84%～60%)，23～30 min(60%～50%)，30～31 min(50%～0%)，31～34 min(0%)；流動相B的梯度變化為：0～6 min(5%～10%)，6～8 min(10%)，8～10 min(10%～16%)，10～23 min(16%～40%)，23～30 min(40%～50%)，30～31 min(50%～100%)，31～34min(100%)；進樣量2 μL；流速1.6 mL/min。為了檢測到檢測樣中的脯氨酸(Pro)，反應27 min后將檢測器激發波長和發射波長分別調整至266、305 nm。

1.5 數據處理

所有數據均采用平均值±標準差來表示。采用SPSS 24.0對氨基酸數據進行統計分析；并利用R語言、SPSS和SIMCA 14.1進行聚類和主成分分析(principal component analysis，PCA)。所有檢驗的統計學顯著性標準均為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸的色譜圖與聚類分析

通過HPLC的FR檢測器測定氨基酸標準液(圖1-a)。

a-氨基酸標準液；b-駝乳；c-牛乳；d-山羊乳圖1 氨基酸標準液、駝乳、牛乳和山羊乳的HPLC圖Fig.1 The HPLC chromatogram of amino acid standard solution, camel, cow and goat milk

圖1可以看出FR檢測器對于17種氨基酸均有很好的響應值，能夠有效分離。重復3組平行樣，其結果重現性好，說明FR檢測器對氨基酸種類的檢測具有良好的效果。在此基礎上，采用FR檢測器對未處理過的駝乳、牛乳和山羊乳樣品進行氨基酸含量的檢測，并采用內標法進行定量，如圖1所示，3種原乳中所有氨基酸均被檢出，各色譜峰峰形尖銳，且無雜峰干擾，分離度良好。

未處理組的駝乳、牛乳和山羊乳氨基酸色譜圖，結合氨基酸標準品對3種畜乳中17種氨基酸含量進行分析，并借助聚類熱圖完成了可視化展示(圖2)。3種乳均獲得了17種氨基酸，且不同乳中的氨基酸含量差異較大。所有的檢測乳樣中Glu的聚類顏色最深(紅色)，說明含量最高；其次是Leu和Pro；而Glu的聚類藍顏色最深，說明在3種乳中其含量最低。從整體聚類特性來看，3種乳均按照重復次數聚為1簇；且駝乳和山羊乳先聚在一起，然后再與牛乳聚類；說明相比牛乳，駝乳和山羊乳中的氨基酸含量更接近。

CM-駝乳；NR-牛乳；YR-山羊乳圖2 駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成聚類圖Fig.2 Cluster analysis of amino acid composition in camel, cow and goat milk注：1、2和3分別為試驗的3次重復

2.2 駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸含量比較分析

乳中氨基酸含量及組成是評價蛋白質營養價值高低的主要因素，會直接影響到乳中蛋白質營養價值[15]。由表2可知，駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成和相對含量差異顯著。3種原乳中，總氨基酸(total amino acid，TAA)的含量具有顯著差異(P<0.05)；其中駝乳中TAA含量最高，為46.47 mg/g，牛乳最低，為30.37 mg/g。必需氨基酸(essential amino acid，EAA)的含量也存在顯著差異(P<0.05)；駝乳中的含量最高，其次是山羊乳，而牛乳中EAA的含量最低。3種原乳中含量最高的EAA為Leu。Leu可促進機體內肌肉蛋白質的合成，原料乳中較高含量的Leu，可提高機體肌肉蛋白質的代謝[19]。此外，研究表明Leu具有降低血糖的作用；相比牛乳和山羊乳，駝乳中Leu的含量分別高出1.5倍和0.8倍，這也許是駝乳具有降糖作用的另一證據。3種畜乳的EAA含量占據第2位的為Lys，尤其在駝乳中，其含量達到了3.40 mg/g，顯著高于牛乳和山羊乳(P<0.05)。Lys作為人體第一限制氨基酸，在調節人體新陳代謝、增強抗病力等方面起著重要作用[20]。因此，推測駝乳具有的醫療保健作用，可能與乳中較高含量的Lys有關。此外，駝乳中的非必需氨基酸(non essential amino acid，NEAA)總量顯著高于牛乳和羊乳(P<0.05)，其中除了Gly和Ala的含量顯著低于山羊乳(P<0.05)，其余NEAA的含量均高于山羊乳。而駝乳中所有的NEAA含量均高于牛乳。

表2 駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸含量比較 單位：mg/g

采用SIMCA軟件對未處理的駝乳、牛乳和山羊乳中17中氨基酸進行了PCA。由圖3可見，主成分1和主成分2很好區分3種畜乳，且同一種乳的3次重復明顯的聚在一起，表明不同畜乳中氨基酸含量存在一定差異性。PCA的結果再次證實了表3的結果，且與楊惠茹等[16]的研究結果一致。

圖3 駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸含量的PCAFig.3 PCA of amino acid of camel, cow and goat milk

2.3 熱處理對駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成的影響

2.3.1 熱處理對駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成的比較分析

目前，原料乳不同程度的熱處理殺菌是保證產品質量、延長產品保質期最主要的方式。不同熱處理方式對原料乳營養價值有不同程度的影響，對其氨基酸含量也有不同程度的影響。在不同熱處理(LTLT、HTST和UHT)條件下，駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成變化見表3。與未處理組相比，加熱處理會增加3種畜乳中TAA和EAA的含量(表2和表3)；眾所周知，原料乳中存在多種酶類物質，在加熱過程中耐熱酶會使乳中蛋白質酶解，導致TAA的含量增加。此外，相比未處理組鑒定到的7種EAA，Thr、Ile、Phe和Leu氨基酸含量在3種熱處理條件下都有所增加，而其余氨基酸(除Asp外)含量在加熱處理過程中呈現了增加或減少的無規則變化(表2和表3)。研究表明，原料乳在加熱過程中，蛋白質會酶解或氨基酸之間的化學鍵會斷裂，使得氨基酸自身會發生裂解，或與乳中的糖類物質發生美拉德反應，導致游離氨基酸含量增加或減少[21-22]。

從表3可知，3種乳經過LTLT熱處理后TAA和EAA的含量均有上升趨勢，而相比LTLT熱處理，HTST和UHT熱處理對3種乳的影響各不相同。駝乳和山羊乳經過HTST和UHT熱處理后，乳中TAA和EAA的含量顯著降低(P<0.05)，而3種熱處理條件對牛乳中TAA和EAA含量的影響差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同熱處理駝乳、牛乳和山羊乳的氨基酸組成 單位：mg/g

3種乳在不同熱處理條件下，其EAA的種類變化也各異。與LTLT處理相比，HTST和UHT處理駝乳中Val、Phe、Lys和Leu的含量均顯著降低(P<0.05)，而HTST和UHT2個處理組之間無顯著差異(P>0.05)。在3種熱處理條件下，駝乳中Met和Ile的含量都發生了顯著的變化(P<0.05)。與LTLT處理相比，HTST和UHT處理后牛乳中7種EAA的含量均無顯著變化(P>0.05)。此外，熱處理對山羊乳中Met和Leu的含量影響最大；與LTLT相比，HTST和UHT加熱處理會顯著降低山羊乳中Met的含量，而Leu的含量隨著溫度的升高，呈先降低后上升的趨勢(P<0.05)。此外，與原料乳相比，熱處理條件會增加3種畜乳中的鮮味氨基酸的含量，如Glu和Asp。因此，推測鮮味氨基酸含量的增加，是提高原料乳中乳香味、使其具有獨特風味的主要原因。

2.3.2 熱處理對駝乳、牛乳和山羊乳氨基酸相對含量分析

由圖4可知，駝乳、牛乳和山羊乳中EAA/TAA均達到了40%以上，分別是41.16%、40.07%和40.46%；且EAA/NEAA也均達到了65%以上，分別是69.97%、66.83%和67.93%，均符合并高于FAO/WHO理想蛋白相應指標(40%和60%)的標準[23]。3種乳在不同熱處理條件下，由于氨基酸含量的改變，EAA/TAA和EAA/NEAA發生了不同程度的改變。駝乳在3種不同熱處理條件下，乳中EAA/TAA>40%，且EAA/NEAA也處于較高值，其中LTLT和UHT處理條件下EAA/NEAA均達到了70%以上。對于牛乳來說，加熱處理對其EAA的含量影響較大，因此LTLT和HTST處理條件下EAA/TAA的含量均<40%；而3種熱處理條件下，牛乳EAA/NEAA均大于65%。羊乳在3種熱處理條件下EAA/TAA和EAA/NEAA均高于40%和65%，且UHT處理條件下EAA/NEAA達到了70%以上。

圖4 不同熱處理條件下3種乳中Met+Cys、Phe+Tyr、EAA/NEAA和EAA/TAA相對含量分析Fig.4 Content of Met+Cys, Phe+Tyr, EAA/NEAA and EAA/TAA in camel, cow and goat milk under different heated treatment

Met和Cys是乳中含硫的EAA，含硫氨基酸是在熱處理過程中對食品風味影響較大的一類氨基酸。其在加熱過程中分解產生乙醛、半胱胺等物質，是乳香味的重要組成部分。相比未處理組，LTLT和HTST熱處理條件下，3種乳中Met+Cys的含量升高，而在UHT熱處理條件下，其含量有所降低，說明LTLT和HTST處理使乳中的乳香味得到進一步改善。

2.4 熱處理對駝乳、牛乳和山羊乳氨基酸組成的PCA的影響

為了進一步分析加熱處理對3種畜乳中氨基酸組成的影響，采用SPSS軟件對3種熱處理條件下的駝乳、牛乳和山羊乳中17種氨基酸進行PCA。如表4所示，從17種氨基酸組分中提取出2個主成分(特征值>1)，主成分1的特征值為14.60，特征貢獻率為85.87%，主要影響因子為Asp、Ser和His(表5)；主成分2的特征值為1.34，特征貢獻率為7.90%，主要影響因子為Gly和Ala；主成分1和主成分2的累計貢獻率為93.77%。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

表5 PC系數向量值Table 5 Vectors of principle components

3種熱處理條件下的駝乳、牛乳和山羊乳中17種氨基酸組成的PCA圖如圖5所示，3種熱處理條件下的駝乳的云圖分布于同一相區，共同聚類于三維圖右方，且與牛乳和山羊乳的距離較遠，再次驗證了圖3的結果，表明未處理組或即使經過了加熱處理，3種乳中氨基酸的含量存在一定的差異。LTLT和UHT熱處理條件下的駝乳氨基酸，從空間上聚類的更近一些，說明LTLT和UHT處理對駝乳氨基酸含量的影響更相似。對于牛乳和山羊乳，LTLT和HTST處理條件下的聚類更近一些，而UHT處理產生了較大的聚類距離；說明UHT加熱處理對牛乳和山羊乳中的氨基酸組成影響較大。以上結果表明不同熱處理方式對3種畜乳的氨基酸組成有明顯的影響。利用17種氨基酸組成繪制PCA圖，可很好地區分不同熱處理樣品。

圖5 不同處理條件下駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成的PCA圖Fig.5 Principal component analysis plot of amino acid composition in camel, cow and goat milk under different heated treatment

3 結論

本研究基于HPLC技術，對駝乳、牛乳和山羊乳在3種不同熱處理條件下(LTLT，65 ℃、30 min；HTST，85 ℃、15 s；UHT，135 ℃、5 s)的氨基酸組成進行了比較分析。HPLC的FR檢測器對乳中17種氨基酸均有很好的響應值，且各色譜峰峰形尖銳、無雜峰干擾。對3種乳中的氨基酸組成進行分析發現，未處理和加熱處理的駝乳、牛乳、山羊乳中氨基酸組成和相對含量差異顯著，且UHT加熱處理的牛乳和山羊乳中氨基酸的組成差異較大；而相比牛乳和山羊乳，加熱處理對駝乳中氨基酸的影響較低。同時，加熱處理會不同程度的增加3種乳中Glu、Asp、Met和Cys的含量，說明加熱處理使乳中的乳香味得到進一步改善。因此，生產廠家通過加熱處理，不僅殺滅乳中微生物、增加其保質期，而且還可提高產品的風味，增加消費者的購買欲。由此可見，不同的熱處理方式對駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸的組成和含量產生不同的影響。本研究為生產加工不同熱處理品質的駝乳、牛乳和山羊乳產品提供依據。