不同糖類和蛋白質濃度對核桃乳發酵及其感官特性的影響

斯夢，孔祥珍，張彩猛，華欲飛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

我國核桃產量高居世界第一。核桃仁營養豐富，具有益智補腦功效。以干物質含量計，核桃仁中，油脂占55%～70%，蛋白質占18%～24%，且 18 種氨基酸齊全，8 種必需氨基酸的含量合理[1]。以核桃仁為原料研制植物酸奶具有較好的市場前景，且乳酸菌發酵核桃乳，既能保留核桃的營養價值，又能產生乳酸及其他乳酸菌代謝產物如功能活性物質γ-氨基丁酸及共軛亞油酸[2-4]。T/WSJD 12—2020《植物蛋白飲料 植物酸奶》規定，使用單一植物原料包括巴旦木、杏仁和核桃等提供蛋白質的植物酸奶，蛋白質含量要求不低于1%，糖含量不高于10%。碳氮源對乳酸菌生長繁殖以及發酵產酸十分重要。但是目前以核桃仁為原料，關于糖類和蛋白質濃度對核桃乳發酵特性的影響研究較少。有研究報道，核桃乳中的糖類物質較少，只含有少量的蔗糖、棉子糖、麥芽糖、葡萄糖和果糖，無法滿足乳酸菌的正常發酵，因此應外加碳源促進發酵[5]。夏君霞等[6]優化得到益生菌發酵純核桃乳的工藝中碳源添加比例為m(葡萄糖)∶m(蔗糖)=5∶2。

核桃蛋白質由谷蛋白(72.06%)、球蛋白(15.67%)、清蛋白(7.54%)和醇溶谷蛋白(4.73%)構成[7]。可見核桃蛋白主要是谷蛋白，因此溶解性較差[8]。由于蛋白質的性質差異，乳酸菌在核桃乳中的適應力弱，產酸性能有所下降[9]。目前很多研究報道都是通過外加氮源(牛奶、大豆)來促進核桃乳發酵。ILYASOLU等[10]用核桃漿(10%～50%)和脫脂牛奶(50%～90%)制備富含多不飽和脂肪酸的酸奶。賈建會等[11]以大豆和核桃為主要原料，研究乳酸發酵制作核桃酸豆乳的工藝。本文以核桃仁為原料，使用直投式酸奶發酵劑制備發酵核桃乳，根據發酵特性和感官評價篩選出合適的糖類和蛋白質濃度，進一步提高發酵核桃乳的酸度，為工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

核桃仁(遼核1號)，河北涉縣締鑫食品加工廠；直投式酸奶發酵劑(德氏乳桿菌保加利亞亞種，嗜熱鏈球菌)，丹尼斯克公司；蔗糖，市售；葡萄糖，浙江一諾生物科技公司；大豆，市售；新西蘭恒天然脫脂乳粉，恒天然商貿(上海)有限公司；MRS固體培養基，杭州百思生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備

YJ-HS-1超凈工作臺，無錫一凈設備有限公司；AB204分析天平、PHS-3TC數顯pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀、DSX-18L-1手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SC202-2電熱恒溫培養箱，江蘇南通實驗電器廠；BLST4090B-073攪拌器，東莞匯勛電器有限公司；JML-65立式膠體磨，溫州強忠機械科技有限公司；FA25高速剪切機，上海弗魯克流體機械制造有限公司；AH210高壓均質機，ATS工業有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫療儀器廠；TA-XT-Plus質構儀，英國SMS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵核桃乳的制備工藝流程

核桃仁→去皮→打漿→磨漿→剪切→攪拌→調配→均質2次(30～40 MPa)→滅菌(95 ℃，10 min)→冷卻到室溫→接種直投式酸奶發酵劑→發酵(42 ℃)→冷藏后熟(4 ℃)

1.2.2 發酵復原乳制備工藝流程

脫脂奶粉→60 ℃去離子水溶解(控制蛋白質質量分數1.5%)→滅菌(95 ℃，10 min)→冷卻至室溫→接種直投式酸奶發酵劑→發酵(42 ℃)→冷藏后熟(4 ℃)

1.2.3 發酵豆乳工藝流程

大豆→浸泡→磨漿(控制蛋白質質量分數1.5%)→滅菌(95 ℃，10 min)→冷卻至室溫→接種直投式酸奶發酵劑→發酵(42 ℃)→冷藏后熟(4 ℃)

1.2.4 培養基的配制

MRS固體培養基(g/L)：蛋白胨10、牛肉粉5、酵母粉4、葡萄糖20、K2HPO42、檸檬酸三銨2、乙酸鈉5、MgSO40.2、MnSO40.05、吐溫-80 1 mL，瓊脂15，調節pH至6.2。

1.3 理化指標的測定

1.3.1 pH值的測定

采用PHS-3TC型數顯pH計測定。

1.3.2 酸度的測定

根據GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品中酸度的測定》中第二法pH計法測定。

1.3.3 糖類成分及含量的測定

根據GB 5009.8—2016《食品安全國家標準 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》中第一法高效液相色譜法(HPLC)測定。HPLC分析條件：色譜柱：Hypersil APS2(4.6 mm id×250 mm)；流動相V(乙腈)∶V(水)=70∶30；檢測器：示差折光檢測器；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣體積10 μL。

1.3.4 乳酸菌活菌數的測定

根據GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物檢驗 乳酸菌檢驗》測定乳酸菌活菌數。

1.3.5 緩沖能力的測定

參考SALAüN等[12]的方法。取30 mL樣品，室溫下滴加鹽酸標準溶液，邊加邊攪拌，從樣品初始pH滴定至pH為3.9，每隔0.2pH值記錄鹽酸溶液消耗的體積以及樣品pH值，根據公式(1)計算樣品的緩沖能力。

(1)

式中：dB/dpH，樣品的緩沖能力；V1，樣品的體積，mL；V2，鹽酸標準溶液消耗的體積，mL；c(HCl)，鹽酸標準溶液的摩爾濃度，mol/L；ΔpH，鹽酸標準溶液滴定前后樣品pH值的變化量。

1.3.6 三氯乙酸-可溶性氮的測定

參考CHEN等[13]的方法并作適當修改。稱取適量待測樣品加入相同體積30%(質量分數)的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液，使體系中TCA的終質量分數為15%，混勻，室溫靜置1 h后離心(7 690×g，10 min，4 ℃)，再用濾紙過濾，所得濾液用凱氏定氮法測定，為濾液可溶性氮含量與樣品總氮含量的比值。

1.3.7 質構特性的測定

參考ZHOU等[14]的方法并做適當修改。采用質構儀對發酵核桃乳進行測定，采用圓柱形探頭P25；測試前探頭下降速度1.0 mm/s；測試速度1.0 mm/s；測試后探頭回程速度1.0 mm/s；應變程度30%。

1.3.8 感官評定

參考RHB 104—2020《發酵乳感官評鑒細則》。選取8名經過培訓的同學組成感官評定小組，分別對發酵核桃乳的色澤、滋味、氣味和組織狀態打分。在計算過程中先將各組得分最大值和最小值去除后計算各個指標的平均值，具體指標分值如表1所示。

1.4 數據分析

所有樣品均重復測定3次，實驗數據以平均值±標準差表示，借助Origin軟件得到pH和酸度隨發酵時間變化的趨勢圖。采用SPSS 23.0對數據進行顯著性分析，P<0.05認為差異顯著。

表1 發酵核桃乳感官評分標準Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented walnut milk

2 結果與分析

2.1 糖類對核桃乳發酵的影響

2.1.1 核桃乳自身糖類對發酵特性的影響

圖1是在不外加碳源條件下，復原乳、豆乳和核桃乳(蛋白質質量分數均為1.5%)在發酵過程中pH和酸度的變化。

a-pH;b-酸度圖1 不外加碳源條件下復原乳、豆乳和核桃乳發酵過程中pH和酸度的變化Fig.1 Changes of pH and acidity during fermentation of reconstituted milk, soybean milk and walnut milk without additional carbon source

由圖1-a 可知，在發酵6 h時，復原乳和豆乳的pH趨于一致，呈緩慢下降趨勢，核桃乳pH在發酵6～10 h無明顯變化。由圖1-b可知，發酵10 h，復原乳酸度可達41 °T，豆乳是27 °T，核桃乳是13 °T，3者間均有顯著性差異(P<0.05)。復原乳和豆乳在前2 h發酵速率趨于一致，在2～10 h發酵速率為復原乳>豆乳>核桃乳，且核桃乳在發酵6 h后酸度不再增加，可見乳酸菌依靠核桃乳自身糖類難以達到發酵終點(pH≤4.5，酸度≥30.0 °T)，所以需要外加碳源來促進發酵。

表2為復原乳、豆乳和核桃乳糖類組成及含量。各組滅菌乳蛋白質濃度均為1.5%，使用HPLC法對糖類組成成分和含量進行測定。復原乳含有乳糖(2.527 g/100 g)；豆乳糖類種類較豐富，包括葡萄糖、蔗糖、棉籽糖和水蘇糖；核桃乳含有葡萄糖和蔗糖。乳糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖和水蘇糖都是可被乳酸菌發酵降解的糖，經發酵后主要代謝產物為乳酸[15-16]。復原乳、豆乳和核桃乳可發酵糖類總量分別為2.527、0.279和0.099 g/100 g，有顯著性差異(P<0.05)。

表2 復原乳、豆乳和核桃乳糖類組成及含量Table 2 Composition and content of sugars in reconstituted milk, soybean milk and walnut milk

2.1.2 外加碳源對核桃乳發酵特性的影響

圖2為外加葡萄糖(1.0%～5.0%，質量分數)核桃乳發酵過程中pH和酸度的變化。由圖2-a可知，添加1.0%葡萄糖，發酵過程中pH下降最慢；添加(2.0%～5.0%)的葡萄糖，發酵過程中pH變化曲線幾乎重合。由圖2-b可知，添加葡萄糖(3.0%～5.0%)發酵24 h后，酸度在25 °T左右，其中添加3.0%葡萄糖的發酵核桃乳酸度最高；并且添加3.0%～5.0%葡萄糖后的酸度同添加1.0%～2.0%的葡萄糖相比存在顯著差異(P<0.05)。

a-pH;b-酸度圖2 外加葡萄糖核桃乳發酵過程中pH和酸度的變化Fig.2 Changes of pH and acidity during walnut milk fermentation with glucose

圖3為外加蔗糖(1.0%～9.0%，質量分數)核桃乳發酵過程中pH和酸度的變化。由圖3-a可知，發酵0～4 h，各組pH變化曲線幾乎重合，而后曲線出現較大變化；發酵24 h后，添加1.0%蔗糖和3.0%的核桃乳pH值無顯著差異(P>0.05)，而蔗糖添加量為5.0%、7.0%和9.0%時，pH值存在顯著差異(P<0.05)。

a-pH;b-酸度圖3 外加蔗糖核桃乳發酵過程中pH和酸度的變化Fig.3 Changes of pH and acidity during walnut milk fermentation with sucrose

由圖3-b可知，隨著蔗糖添加量的增加，酸度也隨之增加，發酵24 h后，添加1.0%和3.0%蔗糖，酸度無顯著差異(P>0.05)，而添加3.0%、5.0%、7.0%和9.0%蔗糖酸度均存在顯著差異(P<0.05)，而且添加7.0%和9.0%蔗糖的發酵核桃乳的酸度均超過30 °T，達到發酵終點。所以對于核桃乳體系，添加蔗糖更有利于乳酸菌產酸。

2.1.3 外加蔗糖對發酵核桃乳感官特性和活菌數的影響

圖4為外加蔗糖(1.0%～9.0%，質量分數)后制備的發酵核桃乳的感官評價結果，由色澤、滋味、氣味和組織狀態4部分組成。感官特性可直觀反映發酵核桃乳的品質。從色澤看，添加5.0%、7.0%蔗糖的發酵核桃乳的得分顯著高于1.0%、3.0%和9.0%添加量組；從滋味看，添加7.0%蔗糖制備的發酵核桃乳的得分最高，添加7.0%和9.0%蔗糖組的得分顯著高于1.0%、3.0%和5.0%蔗糖添加組，可見較高的蔗糖添加量使得發酵核桃乳滋味更佳。從氣味和組織狀態看，7.0%蔗糖添加量組的得分最高，且與5.0%和9.0%蔗糖添加量組的得分無顯著性差異(P>0.05)，但顯著高于1.0%和3.0%蔗糖添加組的得分。這說明不同的蔗糖添加量對發酵核桃乳的感官特性有較大影響，3%及以下蔗糖添加量，發酵核桃乳各項指標評分都偏低，蔗糖添加量(5.0%～9.0%)主要影響發酵核桃乳的滋味，對氣味和組織狀態影響不大。綜合考慮，添加7.0%蔗糖制備的發酵核桃乳感官評價最佳。

圖4 外加蔗糖發酵核桃乳的感官評價Fig.4 Sensory evaluation of fermented walnut milk with sucrose

表3為不同蔗糖添加量(1.0%～9.0%，質量分數)的核桃乳發酵24 h并冷藏12 h后的活菌數，結果表明隨著蔗糖添加量的增加，各組的活菌數也隨之增加且均大于106CFU/g。

表3 外加蔗糖發酵核桃乳的活菌數Table 3 The viable counts of fermented walnut milk with sucrose

2.2 蛋白質濃度對核桃乳發酵的影響

2.2.1 蛋白質濃度對核桃乳發酵特性的影響

通過控制磨漿時核桃仁與水的比例，調節核桃乳的蛋白質質量分數為1.0%～3.0%。圖5為不同蛋白質濃度的核桃乳(添加7.0%蔗糖)發酵過程中pH和酸度的變化。核桃乳在發酵過程中pH明顯下降，但不同蛋白質濃度(1.0%～3.0%)的pH差別不大，曲線幾乎重合(圖5-a)，但酸度隨蛋白質濃度的提高而明顯增大(圖5-b)。當核桃乳發酵至pH為4.5時，酸度與其蛋白質濃度呈線性正相關(R2>0.995)，因此蛋白質濃度對提高發酵核桃乳的酸度至關重要。

a-pH;b-酸度圖5 不同蛋白質濃度的核桃乳發酵過程中pH和酸度的變化Fig.5 Changes of pH and acidity during walnut milk fermentation with different protein concentrations

牛奶中的游離氨基酸和肽是乳酸菌生長的主要氮源[17]。對于牛奶酸奶發酵中，嗜熱鏈球菌產生的甲酸、丙酮酸、葉酸等可為保加利亞乳桿菌所利用，同時該菌在發酵中水解乳蛋白產生的游離氨基酸和肽可為嗜熱鏈球菌所利用[18-20]，因此核桃乳體系中游離氨基酸和小肽能促進乳酸菌產酸。TCA-可溶性氮含量用來表征體系中游離氨基酸和小肽的相對含量。表4所示為不同蛋白質質量分數(1.0%～3.0%)的核桃乳的TCA-可溶性氮含量及對應發酵核桃乳中的乳酸菌活菌數。結果表明，不同蛋白質濃度下的TCA-可溶性氮含量無顯著差異(P>0.05)；但在相同體積的核桃乳體系中，蛋白質濃度越高，游離氨基酸和小肽含量越高，且兩者呈線性正相關(R2>0.997)。同時結合圖5-b的數據可見，游離氨基酸和小肽含量越高，對應的發酵核桃乳的酸度也越高。隨著蛋白質濃度的提高，發酵核桃乳中的活菌數也隨之增加，其中蛋白質質量分數為2.0%～3.0%的發酵核桃乳的活菌數均達到107CFU/g。

表4 不同蛋白質濃度核桃乳的TCA-可溶性氮含量及其發酵核桃乳的活菌數Table 4 TCA-soluble nitrogen of walnut milk and viable counts of fermented walnut milk with different protein concentrations

2.2.2 蛋白質濃度對核桃乳緩沖能力的影響

緩沖能力是酸奶發酵過程中菌種生長的一個重要參數。發酵體系的緩沖能力越高，乳酸含量變化引起的 pH 變化就越小，所以具有較大緩沖能力的乳體系更適宜于乳酸菌的生長[21-22]。

由圖6可知，蛋白質濃度越高，核桃乳體系的緩沖能力越強，pH 5.0附近的緩沖能力最大。結合圖5可知，核桃乳發酵8 h后，pH約為5.0，之后繼續發酵，pH下降趨勢慢慢變緩，但發酵核桃乳的酸度增加很快。同時，蛋白質濃度越高，緩沖能力越大，活菌數也越高。另外，隨著緩沖能力的增大，核桃乳發酵體系的pH下降減慢，造成到達發酵終點(pH≤ 4.5)的時間也越長。

圖6 不同蛋白質濃度的核桃乳的緩沖能力Fig.6 Buffering capacity of walnut milk with different protein concentrations

2.2.3 蛋白質濃度對發酵核桃乳質構特性的影響

發酵核桃乳的質構特性可通過硬度、稠度、黏聚性和黏聚指數來表征。而質構特性很大程度上取決于產品成分如蛋白質濃度和脂肪含量等[23-24]。表5為不同蛋白質質量分數(1.0%～3.0%)的發酵核桃乳的質構特性。結果表明，隨著蛋白質質量分數(1.0%～2.0%)的增加，發酵核桃乳質構特性均明顯增強，且硬度、稠度、黏聚性和黏聚指數都有顯著性差異(P<0.05)。但隨著蛋白質質量分數(2.0%～3.0%)的持續增加，在硬度上2.0%蛋白質組和2.5%組無顯著性差異(P>0.05)，與3.0%蛋白質組有顯著性差異(P<0.05)。隨著蛋白質濃度的增加，硬度整體呈增加趨勢，這可能因為蛋白質濃度越高，到達發酵終點時發酵核桃乳的酸度越大，其凝膠強度越大。但因為核桃乳中油脂含量高且核桃蛋白溶解性較差，當蛋白質濃度越高時，形成的酸性凝膠網絡結構較為粗糙, 發酵核桃乳的顆粒感也越強。所以在較高的蛋白質濃度下，稠度和黏聚性不再與蛋白質濃度呈線性正相關。因為發酵核桃乳需要適宜的硬度和稠度來提供順滑的口感，因此2.0%蛋白質的發酵核桃乳的質構更佳。

表5 不同蛋白質濃度的發酵核桃乳的質構特性Table 5 Texture characteristics of fermented walnut milk with different protein concentrations

2.2.4 蛋白質濃度對發酵核桃乳感官特性的影響

圖7為不同蛋白質質量分數(1.0%～3.0%)發酵核桃乳的感官評價結果。在色澤上，不同蛋白質濃度的發酵核桃乳無顯著性差異(P>0.05)，呈乳白色，有一定光澤。滋味上，1.0%蛋白質的發酵核桃乳得分最低，與其他各組有顯著性差異(P<0.05)，口感偏甜。2.0%蛋白質的發酵核桃乳在氣味上得分最高，和1.5%蛋白質和2.5%組得分無顯著性差異(P>0.05)，但與其他2組有顯著性差異(P<0.05)。因為蛋白質濃度越低，核桃自身香氣和發酵香氣越平淡；而蛋白質濃度高，由于核桃乳中油脂含量高，在發酵過程中也會產生一些其他的風味。在組織狀態上，2.0%蛋白質的發酵核桃乳得分最高，和2.5%蛋白質組得分無顯著性差異(P>0.05)，但與其他組均有顯著性差異(P<0.05)。蛋白質質量分數為3.0%時，口感更厚重，但顆粒感更明顯；蛋白質濃度較低組，口感比較稀薄。2.0%蛋白質的發酵核桃乳感官得分最高，酸甜比適宜，核桃的發酵香氣較為濃郁，且比較細膩順滑，黏稠度適中。

圖7 不同蛋白質濃度發酵核桃乳的感官評價Fig.7 Sensory evaluation of fermented walnut milk with different protein concentrations

3 結論

與牛奶復原乳和豆乳制備的發酵乳相比，結合考察核桃乳自身糖類組成，發現核桃乳中可發酵糖類的總量很少，核桃乳發酵6 h后即不再產酸，因此需要外加碳源。通過測定pH、酸度、活菌數和感官評價，確定發酵核桃乳外加碳源為7.0%的蔗糖。通過考察不同蛋白質濃度下核桃乳的發酵特性，發現發酵核桃乳的酸度與核桃乳的蛋白質濃度關系密切。隨著蛋白質濃度的提高，一方面相同體積核桃乳中游離氨基酸和小肽含量增加，進而促進乳酸菌產酸；另一方面緩沖能力提高，適宜的pH環境使得乳酸菌可以更好地生長繁殖，提高了發酵核桃乳的酸度。比較核桃乳的發酵特性、緩沖特性并結合發酵核桃乳的質構特性及感官評價，確定2.0%蛋白質的核桃乳作為發酵基料是較為適宜的。