細菌素CAMT2抗菌納米纖維膜制備及其特性研究

李啟彬，張雪梅，劉穎*，房志家，徐春厚

1(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，廣東省海洋生物制品工程實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江，524088) 2(廣東海洋大學 濱海農業(yè)學院，廣東 湛江，524088)

化學防腐劑的使用越來越受到消費者的排斥，由此刺激了對天然安全的生物防腐劑的研究與開發(fā)[1]，其中，細菌素是微生物核糖體合成的抗菌多肽，由于在消化過程中可被蛋白酶水解，在體內不會產生不利的影響[2]，因此作為天然安全的生物防腐劑替代化學防腐劑受到關注。目前，乳酸鏈球菌產生的細菌素(Nisin)已被60多個國家認為天然安全的食品防腐劑，并被大規(guī)模商業(yè)化生產與應用[3]，但該細菌素僅對革蘭氏陽性細菌有抑制作用[4]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等桿菌屬產生的細菌素或細菌素類物質不僅具有較強的抗菌活性，而且對革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌均有抗菌活性，具有較寬的抗菌譜[1, 5]。

然而，細菌素直接添加到食品中可能會受到食品中脂肪等復雜成分的影響，從而影響細菌素的活性，進而不能達到預期的抗菌防腐效果[6-8]。為了克服以上問題，國內外學者采用微膠囊[9]、納米脂質體[7, 10-11]、靜電紡絲[12-13]等包埋技術，對活性物質進行保護，提高其使用穩(wěn)定性。其中，靜電紡絲技術將帶有電荷的紡絲液在高壓電場的作用下克服表面張力，產生帶電的微小射流，進而被拉伸成絲狀纖維，同時將活性物質包埋于纖維中，最后固化成膜[14]。利用該技術制得的納米纖維膜由于具有比表面積大、孔隙率高、功能特性強、緩釋效果好以及負載量高等優(yōu)點，在活性物質包埋等方面受到青睞[15]。

本研究對象細菌素 CAMT2 是由分離自南海海域寶石石斑魚的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJHD3-06代謝產生的一種新型細菌素，能抑制主要的食品腐敗和食源性致病菌如李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[1]。可耐受高溫達100 ℃并不失活，在pH為2～10具有較強的抗性。其中李斯特菌又被稱為“冰箱殺手”，因其能在高鹽、低溫等逆境中生長，是常見于低溫冰鮮食品中的致病菌，人感染后死亡概率在30%以上，歷年有關低溫下食品被李斯特菌污染致病的安全事件常有報道[16-17]。CAMT2對單增李斯特菌(L.monocytogenes)有明顯的抗菌活性[1, 18]，利用靜電紡絲技術將其包埋于納米纖維膜中，作為食品的活性包裝材料，用于食品(尤其是低溫冷凍食品)的保鮮。通過納米纖維的緩釋作用，CAMT2能較長時間地發(fā)揮抑菌功能，保護食品安全，具有良好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

1.1.1 實驗菌株

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJHD3-06，廣東海洋大學CAMT團隊分離自南海寶石石斑魚腸道，NCBI登錄號：KF585041；單增李斯特菌(L.monocytogenes, LM)ATCC 19111，購自廣東省微生物研究所。

1.1.2 實驗試劑

聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA，重均分子質量75 000～80 000 Da)，上海源葉生物技術有限公司；細菌素CAMT2，實驗室制備；葡聚糖凝膠SephadexG-50，美國GE醫(yī)療集團；甲醇(色譜純)，上海國藥化學試劑有限公司；PBS，碧云天生物技術有限公司；改良TGE培養(yǎng)基(葡萄糖7.15 g/L、FeSO40.11 mg/L、維生素C 0.69 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、陳海水)，自行配制；TSA-YE培養(yǎng)基，北京索萊寶生物技術有限公司。

1.1.3 實驗儀器

SS253靜電紡絲設備，北京永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司；Sorvall LYNX高速落地離心機、Varioskan Flash全自動酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；AKTA purifier 100制備型蛋白質純化系統(tǒng)，美國GE醫(yī)療集團；Agilent 1200半制備高效液相色譜，美國安捷倫科技；FlexSEM4800掃描電子顯微鏡，日本日立高新技術公司；SGW-1傅立葉紅外光譜儀，上海上天精密儀器有限公司；磁力攪拌器、PHSJ-3F數字pH計，上海精密科學儀器有限公司；FDU-1110冷凍干燥機，EYELA東京理化器械株式會社；DW-86L80超低溫冰箱，杭州綠博儀器有限公司；再生醋酸纖維素透析袋(1 kDa)，北京索萊寶生物技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌素CAMT2的制備

按AN等[1]的方法制備細菌素CAMT2，將活化后的108CFU/mL ZJHD3-06種子液按3%接種量接種到改良TGE培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。在磁力攪拌器上，往上清液中緩慢加入硫酸銨粉末，使溶液的飽和度達60%。在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心30 min，收集沉淀物，透析脫鹽后凍干。凍干后產物采用SephadexG-50葡聚糖層析進行純化，以pH 7.0 PBS緩沖液為流動相洗脫，220 nm為檢測波長，收集活性組分。活性組分透析脫鹽后用HPLC進一步純化，使用C18柱，以體積分數為60%的甲醇-水溶液為流動相洗脫，在220 nm處進行監(jiān)測，收集活性組分，旋蒸除去甲醇，冷凍干燥制備得CAMT2粉末，備用。

1.2.2 細菌素CAMT2抑菌活性測定

CAMT2凍干粉用PBS溶解，使溶液濃度分別為40、60、80 mg/mL，采用濾紙片法[19]測定不同濃度水平的CAMT2對LM的抑菌活性。用生理鹽水稀釋活化后的LM菌液，調整菌液濃度OD600=0.3±0.01，吸取100 μL均勻涂布到準備好的TSA-YE培養(yǎng)基上。滅菌后的直徑為3 mm濾紙圓片充分浸泡CAMT2溶液，貼在涂布有LM的TSA-YE培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察記錄抑菌圈大小。

1.2.3 CAMT2—PVA納米纖維膜的制備

1.2.3.1 紡絲液的制備

基于范笑笑等[20]的方法略加改進，稱取0.8 g PVA浸泡在10 mL去離子水中15 min，待PVA軟化后，加熱攪拌至PVA完全溶解。然后加入CAMT2，攪拌均勻，使其質量濃度達40、60、80 mg/mL。最后超聲10 min脫氣備用。

1.2.3.2 靜電紡絲制備納米纖維膜

將制備好的CAMT2—PVA紡絲液吸入干燥的5 mL注射器中，排出空氣，固定在靜電紡絲設備的微量注射泵上。將注射器前端金屬針頭與高壓直流電源正極連接，以固定在接收器上的鋁箔作為接收屏。在正高壓+28 kV，負高壓-2.7 kV，接收距離15 cm，流速0.06 mL/min的條件下，進行靜電紡絲，制備載細菌素的CAMT2—PVA納米纖維膜，置于烘箱中30 ℃干燥3 d去除殘留溶劑[21]。

1.2.4 CAMT2—PVA納米纖維膜抑菌活性的測定

用打孔器將納米纖維膜制成直徑為3 mm的圓片，貼在1.2.2制備好涂布有LM的TSA-YE培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察記錄抑菌圈直徑。以直徑同為3 mm的不負載細菌素的PVA圓片為空白對照，各平行3組。

1.2.5 CAMT2—PVA納米纖維膜緩釋效應評價

將納米纖維膜制成直徑為3 mm的圓片，分別放入3支離心管中，加入3 mL PBS。室溫無菌環(huán)境下每12 h吸取200 μL緩沖液，使用酶標儀測吸光值，檢測至吸光值穩(wěn)定，實驗設3個平行組，每次吸取后回補等量的PBS。

1.2.6 CAMT2-PVA納米纖維膜形貌觀察

將抑菌效果最優(yōu)的納米纖維膜裁剪成5 mm×5 mm方塊，表面噴鉑金處理，所有樣品噴金10 min。用掃描電子顯微鏡(3.0 kV，5.0× 10.0×)觀察其形貌。

1.2.7 CAMT2—PVA納米纖維膜的結構檢測

將納米纖維膜攤平，放置于傅立葉紅外光譜儀(Fourier transform infrared，FT-IR)接受片上，波數4 000～400 cm-1，掃描速率1 200 cm-1/min。使用origin 9.65對譜圖擬合波峰圖，進行峰值識別，分析納米纖維膜的化學結構[22]。

1.2.8 CAMT2—PVA納米纖維膜對3種水產基質中LM的控制效果

1.2.8.1 三種水產基質平板制備

凡納濱對蝦去頭尾、去殼；新鮮羅非魚去頭尾、魚皮魚骨；新鮮花蛤去殼，分別取肉，將每種基質的肉分別與NaCl質量濃度為9 g/L的生理鹽水以3∶7(g∶mL)的料液比混合，反復均質至乳液狀，煮沸2 min后過濾，收集濾液于錐形瓶中，加2%瓊脂粉，121 ℃、20 min高溫滅菌，冷卻至55 ℃左右，按照1∶100的體積比接種OD600=0.3的LM菌懸液，然后倒平板制得對應水產基質LM指示平板[23]。

1.2.8.2 納米纖維膜對水產基質中LM抑制效果

稱取1.2.4中抑菌活性最好的CAMT2—PVA納米纖維膜4.0 g，置于滅菌后的錐形瓶中，加入50 mL無菌PBS，4 ℃冰箱存放。每12 h吸取200 μL PBS，采用牛津杯法[24]加入到制備好的含LM的水產品基質培養(yǎng)基中，4 ℃下培養(yǎng)，記錄抑菌圈大小，測試7 d，每種基質3個平行，每次吸取后回補等量的PBS[25]。

1.3 數據處理與分析

實驗所得數據使用IBM SPSS 22軟件進行顯著性分析以及使用Origin 9.65軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 細菌素CAMT2電紡前后抑菌活性

靜電紡絲后的納米纖維膜在TSA-YE平板上對LM的抑菌活性如圖1所示，3種濃度的納米纖維膜均有抗菌活性，與紡絲前抑制活性比較見表1，CAMT2質量濃度為40與60 mg/mL電紡前抑菌圈直徑分別為16.42與21.36 mm，而電紡后比電紡前抑菌圈顯著減小，分別減小了6.44與4.90 mm。但當CAMT2質量濃度為80 mg/mL時，電紡前后抑菌圈直徑差異不顯著，電紡后抑菌圈直徑僅減小了0.40 mm，與電紡前比，抑菌活性得到了有效保留。電紡后抑菌圈的小幅縮小推測是電紡過程中較高的電壓使部分的細菌素失活或是細菌素被包埋于納米纖維中不能快速釋放所致[21]。

圖1 不同細菌素濃度的CAMT2—PVA納米纖維膜抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of CAMT2—PVA nanofiber membranes with different bacteriocin concentrations注：1-40 mg/mL CAMT2—PVA納米纖維膜；2-60 mg/mL CAMT2—PVA納米纖維膜；3-80 mg/mL CAMT2—PVA納米纖維膜；4-吸附有80 mg/mL CAMT2細菌素溶液的濾紙片；5-PVA空白對照

表1 不同濃度細菌素CAMT2電紡前后抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of different concentrations of bacteriocin CAMT2 before and after electrospinning

2.2 CAMT2—PVA納米纖維膜緩釋效應

將納米纖維膜浸泡 PBS對PBS中CAMT2的釋放量進行緩釋監(jiān)測，由圖2可知，在0～0.5 d 為PBS滲透進入納米纖維膜高分子體系內部的擴散階段，活性物質CAMT2尚未被釋放出體系外，OD值沒有發(fā)生變化。隨著PBS不斷涌入，納米纖維膜結構逐漸松弛，CAMT2開始從納米體系中釋放，并進入突釋階段，在第0.5～2天表現出OD值急速增大。當PBS大量涌入體系內，導致納米纖維結構出現不均勻現象，甚至崩裂，同時CAMT2接觸到PBS，最終導致負載的CAMT2以較高的釋放速率從納米纖維膜中釋放出來[25]，但在第2天后，CAMT2釋放速率放緩，逐漸進入恒速釋放過程，第4天后釋放量趨于穩(wěn)定。

2.3 CAMT2—PVA納米纖維膜形貌表征

CAMT2質量濃度為80 mg/mL的納米纖維膜的電鏡圖見圖3，CAMT2—PVA纖維直徑相近，為(720±110) nm，纖維表面光滑，無明顯串珠，方向隨機，形成質地緊密的多層網狀結構，此結構有利于活性物質的有效釋放及與食品基質中致病菌的接觸[15]。

圖2 細菌素納米纖維膜緩釋結果Fig.2 Results of sustained release of bacteriocin nanofiber membrane

a-5 000×；b-10 000×圖3 CAMT2—PVA納米纖維膜掃描電鏡結果Fig.3 SEM results of CAMT2—PVA nanofiber membrane

2.4 CAMT2—PVA納米纖維膜FT-IR分析

FT-IR可以對電紡纖維膜的組成和結構進行有效分析(圖4)。

圖4 納米纖維膜紅外光譜Fig.4 FT-IR of nanofiber membrane

由圖4可知，負載細菌素的CAMT2—PVA納米纖維膜與PVA在3 700～3 200 cm-1存在較寬的強吸收峰，歸因于PVA中O—H的伸縮振動[20]，在2 939 cm-1處的吸收峰為亞甲基(—CH2)中C—H的伸縮振動峰[26]，這兩處的吸收峰說明了CAMT2—PVA納米纖維膜存在PVA基質。細菌素CAMT2于3 032 cm-1處的吸收峰歸因于C—H鍵，位于1 684 cm-1的吸收峰可歸因于蛋白質β螺旋N…H氫鍵[27]，位于1 402 cm-1的吸收峰歸因于蛋白質—CH2—鍵的搖擺振動，位于1 064 cm-1左右的特征吸收峰歸因于羧基(COOH)的C—O鍵[28]。CAMT2—PVA對比PVA無新的顯著吸收峰，但CAMT2—PVA位于1 425、1 136與1 093 cm-1處的吸收峰透過率顯著增強，是PVA與細菌素CAMT2各自吸收峰疊加形成的，說明靜電紡絲過程中PVA對細菌素CAMT2進行了有效的物理包埋[29]。

2.5 CAMT2—PVA納米纖維膜對水產基質中LM的控制效應

CAMT2質量濃度為80 mg/mL的納米纖維膜在4 ℃貯藏條件下對3種水產基質中LM均有較好的抑制效果(圖5)，在0～1 d細菌素CAMT2的釋放量較低，未達到最小抑菌濃度，無明顯抑菌圈，未表現出抑菌活性。在第1～1.5天后，CAMT2—PVA纖維膜釋放出的CAMT2濃度開始增加，并陸續(xù)出現了抑菌圈。第1.5天后CAMT2—PVA納米纖維膜中CAMT2的釋放量迅速增加，對LM的抑菌圈直徑顯著增大，但第2天后抑菌圈直徑增加緩慢，第6～9天抑菌圈直徑基本保持穩(wěn)定，這與納米纖維膜的突釋和緩釋階段相對應。由圖5可知，在羅非魚及對蝦基質中抑菌圈大小接近，并均大于在花蛤基質中的抑菌圈大小；所以CAMT2—PVA納米纖維膜在羅非魚、對蝦基質中對LM抑制效果接近，且抑菌效果略優(yōu)于對花蛤基質的效果。

圖5 4 ℃下細菌素納米纖維膜在水產基質中對LM抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of bacteriocin nanofiber membranes on LM in aquatic substrates at 4 ℃

3 結論

本研究以PVA與細菌素CAMT2配制紡絲液，通過靜電紡絲制備CAMT2—PVA納米纖維膜。CAMT2濃度為80 mg/mL制備的CAMT2—PVA納米纖維膜電紡后抑菌圈直徑對比電紡前的無顯著差異，抑菌活性保留效果良好。CAMT2—PVA纖維膜在第0.5～2天為突釋期，細菌素的釋放量隨時間推移顯著增加，第2天后進入緩釋期，細菌素釋放量緩慢上升，第7天后穩(wěn)定。CAMT2—PVA納米纖維膜直徑均勻，分布致密，具有多層網狀結構。說明靜電紡絲過程中PVA對CAMT2進行了有效的物理包埋。在4 ℃下，CAMT2—PVA納米纖維膜在3種典型的水產基質中具有明顯的抑菌效果。

本研究制備了CAMT2—PVA抗菌納米纖維膜，對纖維膜的抑菌能力、緩釋性能和實際應用等進行了評價，但要實際應用于食品包裝材料中仍需要進行力學、疏水性等評價。目前對靜電紡絲包埋細菌素用于食品包裝材料的研究報道仍然較少，所以本研究制備的CAMT2—PVA納米纖維膜具有較大應用開發(fā)前景，希望能夠對因細菌污染食品致病的安全問題有所幫助。