圓苞車前子殼粉對魚糜凝膠熱穩定性的影響及機理研究

朱士臣，陳小草，鄭佳妮，李偉，范文龍，丁玉庭，周緒霞*

1(浙江工業大學 食品科學與工程學院，浙江省深藍漁業資源高效開發利用重點實驗室，國家遠洋水產品加工技術研發分中心(杭州)，浙江 杭州，310014) 2(浙江漁福食品有限公司，浙江 杭州，310014)

近年來，即食食品需求量日益增大。其中即食魚糜制品是以魚肉為原料，經漂洗、斬拌、灌腸、凝膠化加熱、殺菌等工序加工而成的凝膠類制品[1]。生產即食魚糜制品的前提是產品無致病菌且具有較長保質期，其中高溫滅菌是最有效的處理方式。ZHANG等[2]研究發現高溫處理會改變魚糜蛋白三維網絡結構進而破壞其凝膠特性，導致魚糜制品品質降低。此外，高溫處理還可使魚糜凝膠中蛋白含量顯著降低且持水性下降[3]。為了降低高溫處理對魚糜制品的不利影響，提高產品的熱穩定性，目前多以添加外源性添加物(多糖、蛋白、淀粉、預乳化油脂等)為主，魚糜制品熱穩定性的增強程度有限。

圓苞車前子殼粉(psyllium husk powder，PHP)來源于圓苞車前的干燥成熟種子外殼，因其具有豐富的營養功能特性而引起人們關注。PHP于2014年被國家衛計委列為新食品原料，富含膳食纖維、黃酮類、環烯醚萜類和多糖等成分，具有潤腸通便、降低血脂和血糖等作用[4-5]。圓苞車前子多糖屬于陰離子多糖，富含木糖和阿拉伯糖，是一種親水性膠體[6]。周揚等[4]研究發現，添加PHP可以明顯改善豬肉糜的質構特性及持水性。朱亞軍等[7]研究發現添加0.1% PHP可以顯著增加魚糜凝膠的硬度。這表明PHP較強的持水性和吸水膨脹能力有利于肉糜制品形成致密的凝膠網絡，提高產品品質。然而，當前研究主要圍繞PHP對肉糜凝膠品質的影響，關于PHP對魚糜制品熱穩定性的影響及熱穩定機制有待進一步探索。

前期的研究結果表明，添加一定程度的預乳化油脂能夠保持脂質的結構穩定以及增強魚糜的凝膠特性，但對于乳化油脂的種類及乳化程度對魚糜凝膠熱穩定性的影響尚未報道[8-9]。基于此，本文以冷凍鱈魚魚糜為研究對象，將PHP與油脂預乳化處理相結合，研究不同PHP添加量對高溫處理魚糜凝膠的質構特性、動態流變學特性及熱穩定性等的影響，并從分子間作用力、水分分布狀態及魚糜蛋白二級結構等角度，分析不同PHP添加量對魚糜凝膠熱穩定性的影響機制。研究結果可為即食型功能化魚糜制品的開發提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍鱈魚魚糜購自浙江漁福食品有限公司，其水分含量為(74.12±0.24)%；圓苞車前子殼粉購自滄州鄉韻食品科技有限公司，粒徑(4.56±0.16)μm，其中蛋白質(0 g/100 g)，脂肪(7.2 g/100 g)，膳食纖維(90.5 g/100 g)，鈉(16 mg/100 g)；紫蘇籽油，河北家豐植物油有限公司；其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HR2850型飛利浦打漿機，珠海經濟特區飛利浦家庭電器有限公司；CR21GⅡ高速冷凍離心機，日本日立公司；HH-1型數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市江南儀器廠；TA-XT2i型食品物性測試儀，英國Stable Micro System公司；MCR302型高級拓展流變儀，奧地利安東帕有限公司；Q100型差示掃描量熱儀，美國TA公司；UV-VIS型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；MesoMR21-060H-I核磁共振成像分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；HR 800 Lab RAM 顯微共焦激光拉曼光譜儀，法國Jobin-Yvon 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考周揚等[4]的方法并稍作修改。配制蛋白提取緩沖液A(0.1 mol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2和10 mmol/L Na3PO4，pH 7.0)、溶液B(0.1 mol/L NaCl)。用3倍體積的A液將魚糜攪拌洗滌后過濾，重復3次以除去雜蛋白質和其他物質。用3倍體積的B液洗滌，用2層干凈的紗布過濾后，取蛋白懸浮液于4 000 r/min、4 ℃下冷凍離心15 min，沉淀即為提純的肌原纖維蛋白，4 ℃冷藏備用。肌原纖維蛋白提取過程需控制在4 ℃條件下進行，并在2 d內使用。

1.3.2 預乳化油脂的制備

將1.3.1制備的肌原纖維蛋白質量濃度調節為30 mg/mL，以肌原纖維蛋白為乳化劑對紫蘇籽油進行預乳化。將乳化液分為5組，每組乳液中肌原纖維蛋白添加量控制為10 mL，紫蘇籽油為1.2 g(占油脂總添加量的40%)，混合后分別于10 000 r/min乳化均質1 min。

1.3.3 魚糜-脂質復合凝膠的制備

參考ZHOU等[8]的方法并稍作修改。分別取5份100 g的冷凍魚糜，4 ℃半解凍后切成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊放入打漿機內。每份均添加2.5%食鹽、1.3.2制備的乳化液，水分調節至78%。PHP于鹽擂階段以粉末狀態直接添加至魚糜體系中，控制添加量分別為0.25%、0.5%、0.75%和1%(以濕基魚糜質量計)，其中未添加PHP的樣品為對照組。混合樣品于3 000 r/min斬拌5 min(整個過程控制斬拌溫度在8 ℃以下)。將斬拌后的魚漿灌入膠原蛋白腸衣內(Φ22 mm)，排走氣泡后兩端扎緊，采用兩段式加熱(40 ℃，1 h；90 ℃，20 min)，置于高壓滅菌鍋115 ℃滅菌15 min，隨后立即冷卻，于4 ℃冰箱中冷藏過夜，分析各項指標。

1.3.4 凝膠強度

將魚糜凝膠切成Φ22 mm×20 mm的圓柱體，在室溫下平衡30 min后采用TA-XT2i型物性測試儀測定凝膠強度[10]。參數設定如下：探頭P/5S；測前速度1.00 mm/s；測試速度2.00 mm/s；測后速度10.00 mm/s；位移15 mm；觸發力10 g。每組樣品平均測定10次取平均值。

1.3.5 持水性

采用離心法測定凝膠的持水性[4]。將凝膠切成約5 mm×5 mm×5 mm的小塊，準確稱取質量為m1(約3 g)凝膠，用2層濾紙包裹裝入離心管，10 000 r/min離心10 min，取出凝膠并用濾紙擦除表面水分后準確稱量，測得離心后凝膠的質量為m2。凝膠持水性的計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.6 質構

將魚糜凝膠切成Φ22 mm×20 mm的圓柱體，在室溫下平衡30 min后采用TA-XT2i型物性測試儀測定凝膠的質構[11]。參數設定如下：探頭P/36R；測前速度1.00 mm/s；測試速度2.00 mm/s；測后速度10.00 mm/s；應變50%；觸發模式：自動(力)；觸發力10 g。每組樣品平均測定10次取平均值。

1.3.7 流變學特性

采用MCR302型高級拓展流變儀測定魚糜的流變特性[12]。首先將樣品均勻地涂布在測試平臺上，去除氣泡，采用25 mm平板測試。測試參數為：頻率0.1 Hz；應變2.85%；上下狹縫1 mm。樣品由20 ℃以4 ℃/min恒定速度升溫至120 ℃，記錄魚糜在加熱過程中儲能模量(G′)隨溫度升高的變化情況。

1.3.8 熱穩定性

參考JIAN 等[13]的方法并稍作修改。準確稱取15 mg斬拌好的魚糜樣品于鋁坩堝內，以同等質量的空坩堝做參比。升溫速率：10 ℃/min，溫度范圍：20～120 ℃。整個過程在干燥N2下進行，吹掃氣速率20 mL/min，保護氣速率60 mL/min。

1.3.9 微觀結構

將魚糜凝膠切為厚度約1 mm的薄片，于2.5%戊二醛中浸泡固定24 h，用磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.2)漂洗3次，每次計時10 min。隨后依次用50%、70%、80%、90%及100%(體積分數)梯度乙醇進行洗脫，每次計時15 min。最后將處理好的樣品進行冷凍干燥，干燥后的樣品用導電雙面膠固定于樣品臺，經濺射儀噴金后，置于掃描電鏡下觀察[14]。

1.3.10 化學作用力

魚糜凝膠化學作用力的測定參考徐祖東等[15]的方法：魚糜凝膠樣品各取2 g，分別加入10 mL 0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿素(SC)、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(SD)、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.05 mol/L β-巰基乙醇(SE)，混合均勻之后均質1 min，于4 ℃條件下靜置1 h，然后在10 000×g的轉速下離心15 min。用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質的含量。

離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵貢獻表示如下：離子鍵貢獻=溶解于SB中的蛋白質含量-SA中的蛋白質含量；氫鍵貢獻=溶解于SC中的蛋白質含量-SB中的蛋白質含量；疏水相互作用貢獻=溶解于SD中的蛋白質含量-SC中的蛋白質含量；二硫鍵貢獻=溶解于SE中的蛋白質含量-SD中的蛋白質含量。

1.3.11 低場核磁共振(low field nuclear magnetic field，LF-NMR)

采用MesoMR21-060H-I型核磁共振成像分析儀進行T2弛豫時間測定[16]。將魚糜凝膠切成約2 cm的長度，準確稱取其質量，放入直徑為60 mm的核磁共振專用試管，然后置于永久磁場中心位置的射頻線圈的中心，利用標準油樣進行預掃描，尋找磁場中心頻率及磁場脈沖寬度，利用CPMG脈沖序列測定樣品的自旋-自旋弛豫時間T2，測定條件為：主頻率SF=23 MHz，90°脈沖射頻脈寬P1=11 μs，180°脈沖射頻脈寬P2=21.52 μs，信號采樣點數TD=600 032，采樣頻率SW=250 kHz，采樣間隔時間TW=4 000 ms，回撥個數NECH=12 000，累加次數NS=2。重復采集3次獲取測定樣品的T2弛豫時間。利用核磁共振反演軟件進行反演得到T2反演圖譜，并對信號強度進行質量歸一化處理。

1.3.12 拉曼光譜

拉曼光譜通過HR 800 Lab RAM激光拉曼分析儀(配備531.95 nm 氬離子激光光源分析)測定[8]。測試的功率為20 mW，光譜獲取條件為：開孔200 μm，光柵600 g/mm，掃描3次，積分時間60 s，分辨率2 cm-1，數據獲取速度120 cm-1/ min，獲取的拉曼光譜范圍500～4 000 cm-1。測試完成后用Labspec 軟件對拉曼光譜數據進行處理(平滑，多點基線校正去除熒光背景)。

1.4 統計分析

采用Excel 2007對數據進行整理；SPSS 19.0對數據進行方差分析；Duncan法進行多重比較(P<0.05表示差異顯著)；Origin 8.6繪圖。

2 結果與分析

2.1 凝膠強度

凝膠強度是反映魚糜制品品質的重要指標之一。如圖1-a所示，相較于對照組，添加一定量的PHP(0%～0.5%)能顯著增強魚糜凝膠強度(P<0.05)。PHP添加量為0.5%時，魚糜凝膠強度從對照組的1 547.75 g·mm提升至2 204.88 g·mm，提高約42.46%。PHP添加量為0.75%時，凝膠強度有所降低，但仍高于對照度。但隨PHP用量進一步增至1%，凝膠強度顯著低于對照組(P<0.05)。這或許是高溫處理會誘導魚糜肌原纖維蛋白的展開，更多的疏水基團暴露，從而使車前子多糖在高溫條件下能夠與肌原纖維蛋白相互作用，且殼粉中適量膳食纖維填充到蛋白凝膠網絡中，使得凝膠強度增加；而隨著PHP的過量添加(>0.75%)，大量膳食纖維填充到蛋白凝膠網絡中，致使魚糜體系中蛋白質和多糖產生相分離，導致凝膠強度降低[10,17]。因此，殼粉可作為新型多糖用于替代淀粉，用于增強魚糜凝膠強度。

2.2 硬度和持水性

凝膠硬度是儀器模擬口腔二次擠壓凝膠形變所需要的力，硬度變化表明凝膠質地發生改變[11]；持水性是反映魚糜凝膠品質的重要指標，表明凝膠內部結構對魚糜體系所含水分的截留能力，能在一定程度反映魚糜凝膠三維網狀結構的致密程度。如圖1-b所示，高的持水性表明凝膠內部結構致密，具有較好的鎖水能力。

a-凝膠強度；b-硬度與持水性；c-儲能模量(G′)；d-熱穩定性圖1 圓苞車前子殼粉添加量對魚糜凝膠強度、硬度與持水性、流變特性及熱穩定性的影響Fig.1 Effects of the addition of PHP on gel strength, hardness and water holding capacity,rheological properties and thermal stability of surimi gel

當PHP添加量占魚糜質量0.5%時，魚糜凝膠硬度和持水性最高。適量PHP能夠吸收蛋白網絡結構中的水分，提高魚糜凝膠的持水性[4]。因PHP持水溶脹性較強，添加到魚糜體系中會形成一定的腔室結構，并填充至蛋白三維凝膠網絡結構中，對魚糜體系具有一定的穩定作用，從而增強魚糜凝膠的硬度和持水性[18]。此外，PHP結構具有豐富的親水性基團，也賦予魚糜凝膠較高的持水性。但PHP添加量過大(>0.75%)，會導致魚糜體系中蛋白質和多糖產生相分離，形成具有大孔隙和通道的不連貫基質，凝膠網絡在一定程度上被破壞，凝膠保水性下降[10]。周揚等[4]研究發現低殼粉添加量(0.5%～1.0%)能夠增加肌原纖維蛋白凝膠網絡的致密性，改善豬肉糜凝膠的保水性，提高產品凝膠性能，與本研究結果一致。

2.3 動態流變學特性

儲能模量(G′)反映魚糜蛋白凝膠網絡形成情況，表明凝膠彈性特征，又被稱為彈性模量，其中G′值與凝膠性能呈正相關[19]。圖1-c為不同PHP添加量魚糜凝膠在加熱過程中(20～120 ℃)G′值的變化。在一定溫度下，5組魚糜樣品G′值隨PHP添加量的增加表現出先增加后下降趨勢，且殼粉添加量為0.5%時，G′值最大，表明其形成了結構更堅固的魚糜凝膠。這與PHP中的不溶性膳食纖維、膠體成分可以有效填充到凝膠網絡中，使其結構更加致密有關。G′值隨PHP添加量的變化趨勢與質構測試結果相似，這進一步證實了魚糜凝膠特性與PHP濃度的依賴關系。

從動態流變學曲線可以看出，所有組別的魚糜凝膠樣品G′值具有相似的動態溫度掃描曲線，均有3個不同階段組成：在36～44 ℃，5組樣品的G′值均呈增加趨勢，但增幅程度不同。這是由于肌球蛋白輕鏈發生解離，肌球蛋白頭部互相結合，同時魚糜蛋白分子間發生交聯，弱凝膠網絡結構初步形成[12]。而加入少量PHP后，PHP與魚糜中水分結合，形成黏稠狀凝膠，加固了魚糜剛形成的微弱凝膠網絡結構；在44～52 ℃，5組樣品的G′值均快速下降，表明該溫度范圍達到了內源蛋白水解酶的最適溫度，部分肌原纖維蛋白發生降解，氫鍵被破壞，肌球蛋白尾部展開，流動性增強，致使凝膠網絡結構暫時性惡化。此溫度區間為魚糜凝膠劣變溫度，在加熱過程中應盡快通過；在52～120 ℃，隨溫度上升，G′值急劇升高，這是由于肌球蛋白和肌動蛋白重鏈變性伸展，疏水相互作用、二硫鍵及非二硫共價鍵等重要化學鍵逐步形成，使魚糜體系形成穩定有序的熱不可逆凝膠網絡結構。

2.4 熱力學特性

熱變性是魚糜蛋白形成凝膠的先決條件。通過差示掃描量熱(differential scanning calorimetry，DSC)分析可直接反映魚糜凝膠結構對熱處理的抵抗能力[13]。添加不同量PHP的魚糜凝膠DSC譜圖中(圖1-d)5組樣品在加熱過程中均出現一個明顯的吸熱峰，其中添加0.5% PHP的魚糜凝膠相轉變溫度Tmax為116.5 ℃，顯著高于對照組Tmax108 ℃(表1)，這可能是由于PHP中所含多糖與魚糜蛋白間相互作用，形成更為致密的蛋白質三級結構，其空間構象不易被破壞，從而增加了凝膠的熱穩定性。但進一步增加PHP添加量，與魚糜肌原纖維蛋白發生相分離，導致魚糜凝膠網絡結構不均一，從而使Tmax顯著降低。

表1 圓苞車前子殼粉添加量對魚糜凝膠熱力學特性的影響Table 1 The influence of the addition amount of PHP on the thermodynamic properties of surimi gel

2.5 微觀結構

PHP添加量對魚糜凝膠微觀結構的影響如圖2所示。

對照組魚糜凝膠網絡結構較為松散，表面斷裂較多且粗糙不平整；適量PHP(0～0.75%)的添加使魚糜凝膠的三維網絡結構更加緊湊，孔洞大小和分布更加均勻。這是因為高溫處理促使魚糜蛋白結構展開，暴露出更多疏水基團，肌原纖維蛋白與多糖間的相互作用增強，從而使得魚糜凝膠結構更加致密有序[14]。與此同時，PHP屬于親水性陰離子多糖，在高溫處理過程中能夠通過氫鍵作用使游離水向不易流動水和結合水轉變，使魚糜凝膠變得更為緊密牢固，凝膠的保水性提高，這與上述實驗結果相一致。

2.6 化學作用力

魚糜凝膠的三維網絡結構由肌原纖維蛋白及其聚集體間的分子力協同維持。魚糜凝膠的微觀結構在高溫處理過程中不可避免被破壞，這與高溫處理對蛋白質分子間作用力如離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵產生的影響密切相關[20]。如圖3所示，凝膠中疏水相互作用與二硫鍵占比較大，表明兩者對維持魚糜凝膠體系的熱穩定性具有重要作用；而離子鍵和氫鍵屬分子間弱相互作用，易被高溫破壞，因而不是維持凝膠穩定的主要化學作用力[21]。

與對照組相比，PHP添加量對魚糜肌原纖維蛋白間的化學作用力影響顯著。隨PHP添加量增加，離子鍵、疏水相互作用與二硫鍵呈先上升后下降趨勢，氫鍵呈先下降后上升趨勢。離子鍵主要穩定蛋白質的三、四級結構。實驗組離子鍵含量變化是由于適量PHP(陰離子多糖)與其相反帶電氨基酸發生靜電相互作用，致使魚糜凝膠離子鍵顯著增加；隨PHP含量繼續增加，PHP與肌原纖維蛋白的靜電斥力增加，從而不利于有序魚糜凝膠體系的形成。氫鍵在蛋白質二級結構中起重要作用。高溫處理會破壞魚糜肌原纖維蛋白間的氫鍵作用，而隨著PHP添加量的增加，PHP豐富的親水性基團與蛋白間氨基、羧基發生逐漸增強的氫鍵相互作用[15]。實驗組凝膠疏水相互作用增加是由于加入PHP有利于促進油水乳化，使魚糜體系中鹽溶性蛋白逐漸向界面轉移，油脂中不飽和脂肪酸引起更多色氨酸殘基暴露，形成極性環境，促進蛋白質構象變化及其相互作用，增強熱誘導蛋白質的聚集程度；隨PHP含量增加，肌球蛋白對殼粉接觸面積增大，會覆蓋凝膠中暴露的疏水基團，從而降低凝膠的疏水相互作用[22]。二硫鍵的增加主要是由于蛋白質在高溫處理下結構展開，導致更多的巰基暴露，從而氧化生成二硫鍵。而隨著PHP添加量的增加，兩者增強的相互作用抑制了肌原纖維蛋白結構的展開，從而使二硫鍵作用減弱[23]。

2.7 水分分布

利用LF-NMR可以測定魚糜凝膠中的水分分布和流動性變化。凝膠的核磁衰減信號被擬合為3個峰，分別代表結合水(T2b)、不易流動水(T21)和自由水(T22)[16]。圖4顯示了以0.1～10 ms(T2b)、10～100 ms(T21)和100～1 000 ms(T22)為中心的魚糜凝膠T2弛豫時間分布圖。橫向弛豫時間T2大小可反映水分自由度，T2時間越長水分自由度越高；P2為3種不同狀態水分的相對含量，可以反映凝膠中水分的相互轉化情況，表征凝膠保水性變化。與對照組相比，添加少量PHP(0%～0.5%)的處理組中P22均減小，而P2b和P21增大(表2)。這表明適量PHP能降低凝膠中水分自由度，增強結合水和不易流動水與蛋白質結合的能力。或許由于凝膠中原有的不易流動水與魚糜蛋白結合緊密，PHP屬于親水性多糖，在熱處理過程中通過氫鍵與大量自由水相結合，使其轉變為不易流動水和結合水，使肉糜體系變得更為緊密牢固，凝膠的保水性提高[24]。但在PHP添加量較高時，PHP的強吸水溶脹性及大量膳食纖維存在使蛋白質和多糖發生相分離，形成具有大孔隙和通道的不連貫基質，凝膠網絡致密性降低，結合水和不易流動水占比降低，凝膠保水性下降。

圖4 圓苞車前子殼粉添加量對魚糜凝膠水分分布的影響Fig.4 The effects of the addition amount of PHP on water distribution of surimi gel

表2 圓苞車前子殼粉添加量對魚糜凝膠橫向弛豫時間(T2)及水分相對含量(P2)變化的影響Table 2 Effects of the addition amount of PHP on the transverse relaxation time (T2) and the change of relative moisture content (P2) of surimi gel

2.8 圓苞車前子殼粉對魚糜凝膠蛋白質二級結構的影響

利用拉曼圖譜分析了不同PHP添加量對魚糜蛋白構象的影響(圖5)。結果表明，添加PHP使魚糜蛋白的二級結構發生明顯變化。魚糜凝膠中添加少量PHP促使魚糜蛋白的α-螺旋結構向β-折疊和無規則卷曲結構轉變。其中α-螺旋結構向無規卷曲結構的轉變導致包埋于蛋白質分子內的疏水性殘基暴露，疏水作用力增加，魚糜凝膠熱穩定性提高[25-26]。ZHOU等[8]研究報道α-螺旋含量降低，β-折疊含量升高與魚糜凝膠硬度增加密切相關。原因為β-折疊結構表面積更大，水化強度較弱，有利于蛋白之間發生交聯，形成更加致密的魚糜凝膠網絡結構。

a-拉曼圖譜；b-二級結構含量圖5 圓苞車前子殼粉添加量對魚糜凝膠拉曼光譜及二級結構含量的影響Fig.5 Effects of the addition amount of PHP on Raman spectra and secondary structure content of surimi gel

3 結論與討論

本文研究了PHP添加量對高溫處理的魚糜凝膠品質的影響，并從分子間作用力、水分分布以及二級結構等方面揭示了PHP增強魚糜凝膠熱穩定性機制。魚糜凝膠強度、硬度、持水性、儲能模量(G′)和熱變性溫度與PHP添加量表現出非線性的濃度依賴關系。在PHP添加量為0.5%時上述凝膠特性最大。疏水相互作用和二硫鍵是維持魚糜凝膠熱穩定性的主要作用力；PHP可通過影響魚糜肌原纖維蛋白的二級結構以及降低凝膠體系中水分自由度，促使自由水向不易流動水和結合水轉變，從而增強魚糜凝膠的熱穩定性。本研究可為即食型功能化魚糜制品的開發提供借鑒。