微生物強化對西式發酵薩拉米香腸理化指標與揮發性風味成分的影響

張亞琳，陳福生

(華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢，430000)

發酵香腸也稱生香腸，是指將一定比例和大小的豬肉或牛肉等的瘦肉丁及其脂肪顆粒，與適量的蔗糖、食鹽、香辛料等輔料充分混合均勻后，灌進腸衣，經自然或強化微生物發酵后，制成的具有穩定微生物學特性與典型發酵香味的肉制品[1]。在漫長的發展過程中，世界各地都誕生了具有本地特色的發酵香腸，大體上可分為中式和西式發酵香腸兩大類[2]。其中，中式發酵香腸一般在食用前需要蒸煮熟化，而西式的香腸，通常無需蒸煮就可直接食用[3]。意大利的薩拉米香腸是西式發酵香腸中的典型代表之一，因獨特的口感，在歐洲等地擁有很好的知名度，深受消費者歡迎[4]。隨著我國開放程度的日益增加和消費水平的不斷提高，薩拉米發酵香腸等西式發酵肉制品正迅速搶占我國發酵肉制品的高端市場，給我國發酵肉制品產業帶來很大的壓力。

薩拉米發酵香腸的生產過程一般可分為高溫發酵(22～24 ℃)和低溫成熟(10～14 ℃)2個階段，高溫發酵時間通常為7 d，而低溫成熟時間大約為30～40 d[5]。根據發酵過程中是否強化微生物，薩拉米香腸可分為不強化微生物的自然發酵產品，以及強化微生物的強化發酵產品。通常前者的風味特色鮮明，但存在發酵時間長，批次間差異性較大，若發酵條件控制不當，還有可能被有害微生物污染等問題[6]；而后者通過針對性地強化一些有益微生物，不僅可縮短發酵周期，改良香腸的風味，同時還可很好地控制有害微生物生長，降低亞硝酸鹽等有害成分的含量，保證香腸的品質，并保持不同批次產品的一致性[7]。

李超等[8]通過將乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)混合發酵制得營養豐富、口味獨特、風味良好的鴨肉香腸。李靜雯等[9]在山羊肉中添加乳酸片球菌和米根霉(Rhizopusoryzae)混合發酵得到酸度適宜、感官評分高、羊膻味低、風味優良的羊肉香腸。PEDONESE等[10]將清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)和木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)接種到香腸中，發現它們可抑制單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和革蘭氏陰性腐敗微生物等食源性病原菌的生長。

婁地青霉(Penicillumroqueforti)因其對蛋白質和脂肪的分解能力，一直被廣泛用作藍紋奶酪的發酵劑[11-12]。GUO等[13]將婁地青霉接種至雞胸肉中，發現發酵成熟后的雞胸肉由條狀變為顆粒狀，硬度和彈性降低，黏性和持水能力提高，風味化合物尤其是醛類物質的種類和含量都有明顯增加。但將乳酸片球菌和婁地青霉混合強化發酵香腸還未見相關研究報道。本研究擬分別或同時強化乳酸片球菌和婁地青霉，以探究它們對薩拉米香腸發酵過程中理化指標和揮發性風味物質及感官的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗原料、菌種與培養基

豬肉、天然豬腸衣、食鹽、糖、黑胡椒、大蒜粉、肉豆蔻等原輔料，市售。

乳酸片球菌、婁地青霉分別分離自美國Columbus Secchi的薩拉米香腸和意大利的藍紋奶酪。

PDA、MRS培養基，武漢市中南化學試劑三廠;環己酮，色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。其他化學試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

PTDQ型絞肉機，丹徒區辛豐金匯緣食品機械廠；THMGF350A型灌腸機，佛山市順德區騰輝電氣有限公司；TQ8040型氣質聯用儀，日本島津公司；SX811-BS型穿刺式pH計，上海三信儀表廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 薩拉米香腸的制作

1.3.1.1 強化微生物的制備

將乳酸片球菌接種到MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養16 h，轉接3次后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，菌體以無菌生理鹽水洗滌3次后重懸得到菌懸液，備用。

將婁地青霉接種至PDA斜面上，25 ℃培養4 d后，以無菌水洗脫孢子，經3層無菌紗布過濾后，打散孢子，調整孢子濃度至105個/mL，備用。

1.3.1.2 工藝流程

原料肉預處理→預斬→絞制→撒料→接種乳酸片球菌→攪拌→灌裝→表面接種婁地青霉→高溫發酵→低溫成熟→成品

1.3.1.3 操作要點及微生物強化

(1)豬肉處理：將豬肉洗凈并剔除筋膜和淤血后，將肥肉和瘦肉切成長×寬×厚為10 cm×3 cm×3 cm的條塊，肥肉經2 mm孔板切丁，瘦肉以3 mm孔板絞制，按肥瘦比3∶7(g∶g)混勻，得到豬肉預混物。

(2)輔料添加：將輔料按食鹽3%、糖0.5%、黑胡椒0.02%、蒜粉0.3%和肉豆蔻0.02%(占豬肉預混物比例)[14]加入豬肉預混物中，混合均勻。

(3)乳酸片球菌強化：將乳酸片球菌菌懸液接種至(2)的物料中，調整乳酸片球菌的濃度至107CFU/g物料，混勻，得肉餡。

(4)灌腸：將肉餡灌入腸衣(Φ=3 cm)內，1 cm3腸衣內灌肉餡1.5 g，每隔15～20 cm用棉繩結扎，分節。

(5)婁地青霉強化：將(4)中制備的新鮮香腸浸泡于婁地青霉孢子液中5 min，然后瀝干至香腸表面無游離水。

(6)發酵：將新鮮香腸置于恒溫培養箱內發酵。在相對濕度80%，溫度20～22 ℃發酵7 d后，再在相對濕度70%，溫度12 ℃繼續發酵31 d，總共發酵時間為38 d。

香腸發酵分為自然發酵組(CK)，以及分別強化乳酸片球菌(PL)、婁地青霉(PR)及其復合物(PLR)，共4組薩拉米香腸。

CK：由(1)、(2)、(4)和(6)制得，并加入與(3)中菌懸液同等體積的無菌水；PL：由(1)、(2)、(3)、(4)和(6)制得；PR：由(1)、(2)、(4)、(5)和(6)制得，并加入與(3)中菌懸液同等體積的無菌水；PLR：按(1)～(6)制得。

1.3.2 薩拉米香腸主要理化指標的分析

對香腸整個發酵過程中的第0、2、4、6、8、13、18、23、28、33、38 天的pH值、水分含量、亞硝酸鹽含量、酸價進行測定。

1.3.2.1 pH值測定

使用校準后的肉類專用穿刺式pH計插入香腸的兩端及中間3個部位，控制pH計插入深度為4～5 cm，使pH計的電極探頭充分接觸到香腸，待pH計穩定后讀數，取3次結果的平均值。

1.3.2.2 水分含量測定

取適量香腸樣品置烘干箱中，105 ℃干燥至質量恒定，按公式(1)計算水分含量:

(1)

式中：m1，干燥前樣品與稱量瓶質量，g；m2，干燥后樣品與稱量瓶質量，g；m3，稱量瓶質量，g。

1.3.2.3 亞硝酸鹽含量和酸價測定

亞硝酸鹽含量測定參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法；酸價測定參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》中的冷溶劑指示劑滴定法。

1.3.3 揮發性風味物質測定

參照王德寶[15]的方法并稍作修改。稱取剪碎后的香腸樣品2～3 g，置于15 mL頂空瓶中，將老化好的萃取針插入樣品瓶并于60 ℃恒溫水浴鍋中加熱平衡30 min后，推出纖維頭，使纖維頭暴露于樣品上部空間，頂空吸附30 min后拔出，萃取頭在GC-MS進樣口(250 ℃)下解吸附5 min。

GC條件：DB-5石英毛細柱(30 m×320 μm，0.25 μm)，載氣He，流速1 mL/min，進樣時間1 min；升溫程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升溫到150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升溫到200 ℃，最后以20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

MS條件：離子源溫度250 ℃，進樣口溫度250 ℃，質量掃描范圍m/z30-400。

定性定量分析：以Wiley、Nistdemo質譜庫進行定性分析，匹配度≥800為鑒定依據，結合解析譜圖，確定風味物質。采用內標法進行定量，內標物為環己酮。按公式(2)計算：

揮發性風味物質含量/[μg·(100 g)-1]=

(2)

1.3.4 感官評價

參照SIDIRA等[16]的感官評價方法并稍作修改。將發酵38 d成熟的薩拉米香腸切成3 mm左右的薄片，觀察香腸切片的外觀、組織狀態，品嘗香腸的滋味與風味和口感，并進行總體可接受程度評價。評價小組由15名食品專業的學生組成且進行感官評價前未食用刺激性食物。具體評價標準如表1所示。

表1 薩拉米香腸感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of salami

續表1

1.3.5 數據處理

實驗均重復3次，結果表示為平均值±標準差。所有數據均采用 Excel 2010和 SPSS 26.0 軟件進行數據統計處理和顯著性分析(P<0.05)；采用 Origin 2018 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 薩拉米香腸發酵過程中主要理化指標的變化

2.1.1 pH隨發酵時間的變化

pH值對薩拉米香腸的發酵與品質都非常重要，較低的pH值可抑制有害微生物，特別是食源性病原微生物的生長，而且pH值也可影響肉中蛋白質的變性、調節酶的活性，影響產品的黏度、硬度、感官等。由圖1可知，在高溫發酵階段(前7 d)，隨著發酵時間的延長，薩拉米香腸的pH值均呈現迅速下降趨勢。pH值的下降速度PL≥PLR>PR>CK，發酵至第6天時，它們的pH值分別為：(4.75±0.01)、(4.80±0.03)、(4.92±0.03)、(5.23±0.01)；而在低溫成熟階段(7～38 d)，pH值均緩慢上升，發酵結束時(38 d)，pH值分別為：(5.20±0.01)、(5.32±0.03)、(5.39±0.02)、(5.39±0.03)。在高溫干燥階段，微生物尤其是乳酸菌迅速繁殖產生乳酸等有機酸使香腸pH 快速下降，強化微生物的香腸因可產生更多有機酸而使pH值下降速度更快[17]。在強化PR和PLR的香腸中，pH值的下降(高溫發酵階段)和上升(低溫成熟階段)均較強化PL的慢，可能是因為PR在產生有機酸的同時也可分解蛋白質，產生對pH具有緩沖能力的氨基酸[18]。

在整個發酵階段，強化微生物薩拉米香腸的pH值始終低于CK，較低的pH可以抑制有害微生物的生長，更好地保證薩拉米香腸的品質。

圖1 薩拉米香腸發酵過程中pH值變化Fig.1 Changes in pH values of salami sausage during fermentation

2.1.2 水分含量隨發酵時間的變化

香腸中水分的含量對其安全性與貯藏均有重要影響。由圖2可知，在整個發酵過程中，4組薩拉米香腸的水分含量均呈現下降，在第0～18天，強化微生物的薩拉米香腸的水分含量均略高于CK，這與李權威[19]的研究結果一致。可能因為強化微生物后，產生更多水溶性物質，從而將水分“鎖住”，但在第23～38天，4組薩拉米香腸水分含量逐漸穩定并趨于一致，發酵結束時(38 d)水分含量均約為9%，符合世貿組織對薩拉米香腸產品水分含量的要求[G/TBT/N/KEN/1018 Fermented sausages (salami)—Specification]。

圖2 薩拉米香腸發酵過程中水分含量變化Fig.2 Changes in water contents of salami sausage during fermentation

2.1.3 亞硝酸鹽含量隨發酵時間的變化

發酵過程中肉類物料中的硝酸鹽可還原為亞硝酸鹽，可改善香腸的色澤，提高香腸的感官品質，但過量的亞硝酸鹽會給人體健康帶來危害。由圖3可知，在發酵過程中，亞硝酸鹽含量呈現先上升后下降的趨勢，其中發酵的前2 d，亞硝酸鹽的含量快速上升，隨后緩慢上升或下降。CK的亞硝酸鹽含量在0～6 d逐漸上升，之后緩慢下降，而微生物強化組從第2天后亞硝酸鹽含量均開始下降，發酵結束時其亞硝酸鹽含量遠低于CK(P<0.05)?？赡苁窃谳^低pH條件下(圖1)，亞硝酸鹽更容易進一步轉化為亞硝基，并與香腸中的其他物質結合，或PL和PR產生的相關酶使亞硝酸鹽轉化為N2，從而使產品中的最終亞硝酸鹽含量降低[20]。盡管發酵結束時CK中亞硝酸鹽含量(8.74 mg/kg)遠大于強化組，但各組亞硝酸鹽含量都低于國家標準30 mg/kg(GB 2760—2014 《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》)。

圖3 薩拉米香腸發酵過程中亞硝酸鹽含量變化Fig.3 Changes in nitrite content of salami sausage during fermentation

2.1.4 酸價隨發酵時間的變化

酸價顯示了香腸中游離脂肪酸的含量，其高低是衡量脂肪氧化程度的重要指標之一，脂肪過度氧化產生的“哈”味會影響香腸等肉類發酵產品的可接受度。由圖4可知，薩拉米香腸的酸價在整過發酵過程中均呈現不斷上升的趨勢，但強化微生物組的酸價始終低于CK組，且成熟時的酸價顯著低于CK(P<0.05)。這一方面可能是PL和PR產生的過氧化氫酶，阻礙了O2向香腸內部的滲透，從而減緩了脂肪氧化；另一方面，也可能是PL和PR產生的水溶性物質包裹了脂肪粒，更好地阻止了O2與脂肪接觸，從而減緩了香腸中脂肪的氧化[21]。

圖4 薩拉米香腸發酵過程中酸價變化Fig.4 Changes in acid values of salami sausage during fermentation

2.2 揮發性風味成分比較分析

揮發性風味化合物對發酵香腸的發酵香味有著重要貢獻。采用頂空固相微萃取氣相色譜質譜聯用分析了發酵結束時薩拉米香腸中揮發性成分，相應分析結果見電子版增強出版附件(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031260)。

附件表中的結果顯示，強化微生物后對薩拉米香腸的揮發性風味成分有明顯影響。相比于CK，強化微生物后，薩拉米香腸中的醛類、酸類、醇類、酯類與烴類揮發性風味成分的種類和含量均有所增加。尤其是己醛、庚醛、D-檸檬烯、3-蒈烯等對風味產生積極作用的物質含量增加；但2, 6-二叔丁基對甲酚、4, 6-二甲基-十二烷、3, 7-二甲基癸烷、十七烷等產生刺激性不愉快氣味或對風味貢獻較小的成分[22]，在微生物強化的薩拉米香腸中的含量減少甚至消失。

進一步對附件表中的數據分析可知，烴類化合物是薩拉米香腸的主要揮發性風味物質，在強化微生物的薩拉米香腸中，庚烷、2, 4-二甲基-庚烷、十四烷、鄰異丙基甲苯、水芹烯、3-蒈烯、D-檸檬烯、石竹烯等烴類化合物的含量顯著高于CK(P<0.05)；而在酮類風味成分中，具有非常低的感官閾值，也是干腌肉制品中的典型風味的乙偶姻的含量也顯著高于CK(P<0.05)。強化微生物后，還產生了CK中沒有的乙酸異戊酯、己酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸辛酯、己酸乙烯酯等酯類成分，它們可掩蓋發酵香腸中的腐臭味，與香腸的發酵風味緊密相關[23]。另外，強化微生物后，2, 3-丁二醇、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇等發酵香腸中常見的醇類物質的含量均有所上升；己醛，作為肉制品中的典型香氣，被認為是發酵腌制產品中必不可少是一種脂肪醛[24]，強化PL、PR、PLR后，其含量也有明顯上升(P<0.05)。此外，微生物強化發酵后，薩拉米香腸中還含有較高的3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、L-乳酸、辛酸等具有特殊風味的酸類物質。總之，強化PL、PR或PLR后，薩拉米的揮發性風味成分得到了極大的改良和提高。

2.3 成熟薩拉米香腸的感官評價

感官評價是根據香腸的外觀色澤、質構及風味和滋味等特征直觀地對香腸進行評價，從而判斷其品質的一項重要指標。發酵結束時，薩拉米香腸的感官雷達圖如圖5所示，4組香腸在外觀和組織狀態方面無顯著差異(P>0.05)，相較于CK，強化微生物后薩拉米香腸的滋味與風味、口感和總體可接受度提升較為明顯，這與前述風味成分的分析結果相吻合。可能的原因是強化的微生物促進了薩拉米香腸發酵過程中，蛋白質、脂肪等的分解，增加了香腸中揮發性風味物質的含量，從而使香腸具有更加明顯的特征與口感。

圖5 薩拉米香腸感官分析Fig.5 Sensory analysis of salami sausage

3 結論

本研究的實驗結果表明，分別或同時強化PL和PR制得的薩拉米香腸，在感官與風味等方面均優于自然發酵薩拉米香腸(CK)，且同時強化PL和PR的效果最佳。強化微生物后，香腸的亞硝酸鹽含量、酸價均顯著低于CK組(P<0.05)，產生的乙酸異戊酯、己酸異戊酯、乙酸己酯等風味物質更多，香腸發酵香味更好，香腸的安全性和可食用性得到了提高。研究結果對我國發酵香腸等肉制品的研發提供了參考。