CRISPR-Cas系統在細菌基因組編輯和代謝調控中的研究進展

肖雅麗，張建華，鐘耀廣*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海交通大學 農業與生物學院，上海，200240)

CRISPR-Cas系統，即規律成簇的間隔短回文重復序列(CRISPR基因座)及其相關蛋白(Cas基因簇)，廣泛分布于約50%的細菌和約90%的古菌中，是菌體內進化出的一種具有免疫記憶的獲得性免疫防御系統，用于抵御外源遺傳元件的入侵[1]。JINEK等[2]最早證明，來自化膿鏈球菌的II型CRISPR-Cas系統在體外可特異性切割雙鏈DNA，將其用于基因組編輯，具有效率高、成本低、操作簡單等優點。近年來，CRISPR技術的基本結構和作用機制逐漸被闡明，成為了繼鋅指核酸酶和類轉錄激活因子效應物核酸酶技術之后最新的基因組編輯技術，不僅可用于人類的基因治療，還可以用于植物和動物的精確育種以及微生物工程，具有廣闊的發展空間和應用前景。

如今，越來越多的CRISPR-Cas系統被發現和改造并用于細菌基因組編輯及基因表達調控，包括II型CRISPR-Cas9系統、V型CRISPR-Cpf1系統、內源I-B型和I-E型CRISPR-Cas系統。所有這些系統都有自己的特征蛋白、特異性的原始間隔區相鄰基序(protospacer adjacent motif,PAM)等，可根據實驗需求綜合考慮，自由選擇[3]。本文主要從CRISPR-Cas系統的結構、分類、作用機理，及其在細菌基因組編輯和基因表達調控等方面的應用進行綜述，旨在為相關研究提供參考。

1 CRISPR-Cas系統的結構和免疫應答

1.1 CRISPR-Cas系統的結構

CRISPR基因座依次包括前導序列(Leader)、重復序列(Repeat)和間隔序列(Spacer)(圖1)。

圖1 CRISPR-Cas系統結構示意圖[9]Fig.1 CRISPR-Cas system structure[9]

長度可達550 bp的前導序列多位于CRISPR基因座的5′端，直接與第一個重復序列相鄰，富含A、T堿基。前導序列是添加新間隔序列的識別序列，相同的重復序列和特異的間隔序列交替排列于前導序列之后。同一個CRISPR基因座的重復序列高度保守，而不同CRISPR基因座的重復序列在序列和結構上均不相同[4]。入侵病毒或質粒的一個小片段(即原型間隔序列)被整合到CRISPR基因座中即為間隔序列，用于儲存外來遺傳元件的核苷酸信息。CRISPR基因座的兩側是大量極其多樣化的cas基因，其編碼的某些Cas蛋白具有核酸內切酶結構域、RNA和DNA結合域及參與轉錄調控的結構域，在CRISPR-Cas系統的適應性免疫中起著重要作用[5-7]。此外，Cas1和Cas2蛋白存在于大多數已知的CRISPR-Cas系統中，是將原型間隔序列插入CRISPR基因座所必需的[8]。

1.2 CRISPR-Cas系統的免疫應答

CRISPR-Cas系統的免疫應答過程如圖2所示，包括3個主要階段：適應(adaption)、表達(expression)和干擾(interference)[10]。從入侵的DNA/RNA中識別和提取原型間隔序列是CRISPR-Cas系統介導免疫的第一步，也稱為適應階段。首先，多功能Cas1-Cas2復合體識別入侵DNA上的PAM位點，并切割下入侵DNA的一部分(即原型間隔序列)。隨后，原型間隔序列被整合到CRISPR基因座的前導序列和重復序列之間，成為間隔序列。也有一些CRISPR-Cas系統采用另一種適應機制——利用在CRISPR基因座上編碼的逆轉錄酶進行逆轉錄，從而從入侵的RNA中獲取間隔序列[11-12]。

圖2 CRISPR-Cas系統免疫應答3階段[16]Fig.2 Immune process of CRISPR-Cas system[16]

在表達階段，CRISPR基因座中的間隔重復序列通常被轉錄為較長的CRISPR RNA前體(pre-crRNA)。在多亞基效應復合物中的核酸內切酶或者核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的介導下，pre-crRNA被加工成短的成熟CRISPR RNA(crRNA)，每個成熟crRNA分子都包含一段間隔序列和一部分重復序列。成熟的crRNA分子與效應蛋白或多亞基效應復合物結合，形成crRNA-效應復合物[13]。

最后，當宿主細胞受到相同的外來DNA/RNA入侵時，系統發生干擾，成熟crRNA引導Cas蛋白特異性識別PAM位點后，靶向切割入侵DNA或RNA[14-15]。

2 CRISPR-Cas系統的分類和作用機制

2.1 CRISPR-Cas系統的分類

隨著對CRISPR-Cas系統研究的深入，各類不同的CRISPR-Cas系統逐漸被發現，根據系統效應子的不同將其分為2大類：第1類CRISPR-Cas系統的效應子是由多個Cas蛋白組成的多亞基效應復合物；第2類系統的效應子為單一的多域Cas效應蛋白。MAKAROVA等[10]于2020年根據Cas效應蛋白的不同和多亞基效應復合物的差異將CRISPR-Cas系統進一步分為6種類型：第1類包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型；第2類包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型。

第1類系統中，Ⅰ型系統的多亞基效應復合物通常包含1個Cas6亞基、1個Cas5亞基、幾個Cas7亞基和特征蛋白。Ⅰ型系統還編碼解旋酶Cas3，它通常與HD(His-Asp)核酸酶結構域融合。Ⅲ型系統組成類似于Ⅰ型，不同的是，Ⅲ型系統的特征蛋白為Cas10，與HD(His-Asp)核酸酶融合的也是Cas10。與Ⅰ型和Ⅲ型系統差別較大的Ⅳ型CRISPR-Cas系統通常位于質粒上，缺乏cas1、cas2基因以及目標DNA切割酶的編碼基因cas3或cas10，但擁有編碼Cas5 (Csf3)、Cas7 (Csf2)和特征蛋白(Csf1)的基因。根據特征蛋白的不同，Ⅰ型系統進一步細分為I-A到I-F和I-U 7個亞型。I-A到I-D型的特征蛋白分別為：Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas10 d；I-E型的特征蛋白為Cse1和Cse2；I-F型的特征蛋白為Csy1、Csy2、Csy3和Csy6；I-U型的特征蛋白未知[3,17]。

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在第2類系統中，Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型的根本區別在于其效應蛋白的結構不同。Ⅱ型系統的效應蛋白是Cas9，包含2個高度保守的核酸酶結構域：HNH(His-Asn-His)核酸酶結構域和RuvC核酸酶結構域[18]。Ⅴ型系統包括V-A到V-I和V-U 10種亞型，只有V-A型被用于細菌基因組編輯，效應蛋白是Cas12a(Cpf1)，由1 200～1 300個氨基酸組成，僅包含一個RuvC核酸酶結構域[3,19]。VI型系統的效應蛋白為Cas13(也稱C2c2)，包含2個高等真核生物和原核生物核苷酸結合結構域，與任何已知的DNA核酸酶結構域均不同源，靶向RNA[20]。

2.2 CRISPR-Cas系統的作用機制

上述I-VI型的CRISPR-Cas系統中，IV型CRISPR-Cas系統通常位于質粒上，缺乏從入侵DNA/RNA上提取原型間隔序列所需的Cas1和Cas2以及靶向切割入侵DNA/RNA所需的核酸內切酶[17]；Ⅵ型CRISPR-Cas系統只能靶向RNA[20]。下面重點介紹可以靶向切割DNA的Ⅱ型CRISPR-Cas9、Ⅴ型CRISPR-Cpf1和I型CRISPR-Cas系統的作用機制。

2.2.1 Ⅱ型CRISPR-Cas9系統的作用機制

Ⅱ型CRISPR-Cas9系統包含Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA。tracrRNA是由重復序列轉錄而來，負責激活RNase Ⅲ以促進pre-crRNA的加工，生成成熟的crRNA。成熟的crRNA與tracrRNA和Cas9形成復合物，并引導Cas9識別目標DNA中的PAM位點(5′-NGG-3′)。隨后，HNH核酸酶結構域切割外源DNA中與間隔序列互補的單鏈，RuvC核酸酶結構域切割另一條單鏈，使DNA雙鏈斷裂(double stranded break，DSB)，產生平末端。將crRNA與tracrRNA分子進行適當改造，整合為一條RNA鏈，即單鏈引導RNA(single guide RNA，sgRNA)，可以同時發揮crRNA和tracrRNA的功能[9]。

Cas9核酸酶產生的DSB可以通過非同源末端連接途徑或同源定向修復系統進行修復。多數細菌缺少非同源末端連接途徑，需依賴DNA模板介導的同源定向修復途徑完成修復，否則DSB很容易引起細胞死亡[21]。YAO等[22]人為構建了一個CRISPR-Cas9系統(帶有sgRNA和目標基因的同源修復臂)并轉入宿主菌中，該系統識別宿主菌基因組上的目標基因并進行切割，最后通過同源修復臂與基因組上的目標位點發生同源重組而實現基因的缺失、突變或插入。

2.2.2 V型CRISPR-Cpf1系統的作用機制

Cpf1是繼Cas9之后的一種新型核酸酶，與Cas9只識別5′-NGG-3′這一PAM位點不同，它能識別富含T堿基的PAM位點(5′-YTN-3′和5′-TTTN-3′)[3]，擴展了可靶向識別的基因組DNA范圍。此外，CRISPR-Cpf1是目前最簡單的CRISPR-Cas系統，只包含crRNA和Cpf1蛋白。Cpf1不需要tracrRNA的參與就可以將pre-crRNA加工成成熟的crRNA，成熟的crRNA與Cpf1形成復合物并靶向識別目標DNA。然后，Cpf1蛋白依次切割非互補鏈和互補鏈以產生DSB。最后，通過同源定向修復或者非同源末端連接途徑修復DNA斷裂片段。因此，通過設計由間隔序列(23～25 nt)和同向重復序列(19 nt)組成的單鏈向導crRNA來引導Cpf1識別和切割目標DNA并提供同源修復臂修復DSB即可實現細菌的基因組編輯。而且，CRISPR-Cpf1產生黏性末端，與CRISPR-Cas9(產生平末端)相比具有更高的同源重組修復效率，可更簡單高效地編輯細菌基因組[23]。

2.2.3 I型CRISPR-Cas系統的作用機制

3 CRISPR-Cas系統在細菌基因組編輯中的應用

依賴于鋅指核酸酶和類轉錄激活因子效應物核酸酶的基因組編輯技術存在耗時且效率低、需要進行選擇性標記、難以插入大DNA片段以及大片段的刪除和插入會對下游基因造成影響等問題[25]。CRISPR-Cas基因組編輯技術具有快速精確、無標記、簡便高效等優勢，因此被廣泛應用于微生物研究。目前，用于細菌基因組編輯的主要有II型CRISPR-Cas9系統、Ⅴ型CRISPR-Cpf1系統、內源Ⅰ型CRISPR-Cas系統以及由CRISPR-Cas9衍變而來的CRISPR-Cas9n系統。

3.1 CRISPR-Cas9介導的基因組編輯

CRISPR-Cas9是最早被用于細菌基因組編輯的CRISPR-Cas系統。隨著CRISPR技術的發展，有學者[26-27]于2016年開發了一種基于CRISPR-Cas9系統的快速簡便的基因組編輯方法，只需要構建一個質粒便可以在3 d內實現大腸桿菌的基因組編輯，而用傳統的基因組編輯技術大約需要7 d。CRISPR-Cas9不僅縮短基因組編輯周期，還可提高編輯效率。RONDA等[28]利用CRISPR-Cas9系統和λ-Red重組酶在大腸桿菌中同時編輯3個基因，重組效率達到了96.5%～99.7%。相比之下，傳統重組系統的效率僅為0.68%～5.40%。

此外，CRISPR-Cas9系統還可編輯更大的DNA片段。SU等[29]將CRISPR-Cas9系統和λ-Red重組系統結合，成功地將12 kb的DNA片段整合到大腸桿菌W3110的染色體中，編輯效率可達100%。SYNEFIARIDOU等[30]在肺炎鏈球菌D39V中利用CRISPR-Cas9系統實現了長達24 kb的染色體大片段刪除。

3.2 CRISPR-Cas9n介導的基因組編輯

Cas9蛋白造成的雙鏈斷裂有時會導致宿主細胞死亡。為解決這一問題，研究人員通過突變Cas9蛋白的HNH結構域(H840A)或RuvC結構域(D10A)得到了Cas9切口酶：Cas9n (Cas9 Nickase)。Cas9n只 能切割DNA的一條鏈，切口容易修復且脫靶率低。當修復系統無法修復由Cas9引入的DSB時，可嘗試用Cas9n代替Cas9[31]。例如，GOH等[32]使用CRISPR-Cas9n系統在嗜酸乳桿菌NCFM、加氏乳桿菌ATCC 33323和副干酪乳桿菌Lpc-37中進行基因組編輯，實現了300 bp～1.9 kb的染色體缺失，編輯效率為35%～100%。ZHOU等[33]開發了基于CRISPR/Cas9n的基因編輯工具，不僅在惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)中敲除了不同長度(98～4 643 bp)的DNA片段，而且敲入了長度從1.9 kb到15 kb不等的DNA片段。同樣，CRISPR-Cas9n介導的基因組編輯也可有效縮短操作周期。用同源重組雙交換法敲除干酪乳桿菌的單基因至少需要24 d。為了能快速、精確地編輯干酪乳桿菌基因組，SONG等[34]建立了CRISPR-Cas9n(D10A)系統，將編輯時長縮短至9 d，單基因敲除效率最高可達65%。

3.3 CRISPR-Cpf1介導的基因組編輯

繼CRISPR-Cas9之后，具有結構簡單、應用范圍廣、基因組編輯效率高等優點的CRISPR-Cpf1系統被開發和應用。LI等[35]使用CRISPR-Cpf1和同源定向修復系統成功敲除了天藍色鏈霉菌的actI-orf1和redX基因，單基因編輯效率為90%～95%，證明了該系統的簡單高效，可用于多種基因組工程。ZHAO等[36]將CRISPR-Cpf1系統和核酸外切酶-重組酶(RecET)系統結合起來，實現了谷氨酸棒桿菌ATCC 14067基因組的大片段缺失。其中，1 kb和20 kb基因缺失的編輯效率分別為79.6%和36.4%。WU等[37]改造新弗朗西斯菌(Francisella)U112的CRISPR-Cpf1系統并將其用于枯草芽孢桿菌，以100%的效率實現了單基因插入、雙基因敲除和多點突變(最多6個)。同年，HAO等[38]借助CRISPR-Cpf1系統以高編輯效率精確地實現了枯草芽孢桿菌的基因敲除，其中包含一個38 kb的超大基因簇。

3.4 內源Ⅰ型CRISPR-Cas介導的基因組編輯

第2類CRISPR-Cas系統中的CRISPR-Cas9/Cpf1是強大的基因組編輯工具，然而Cas9或Cpf1作為一種異源蛋白很難被引入某些宿主菌中，從而難以進行基因組編輯。據報道，大多數的CRISPR-Cas系統屬于第一類，且Ⅰ型最為常見[5]。因此，可以借助宿主菌體內的I型系統來實現基因組工程，即構建內源I型CRISPR-Cas系統，利用內源的Cas蛋白靶向切割宿主菌基因組上的目標基因。

PYNE等[39]設計了內源I-B型CRISPR-Cas系統，成功刪除了巴氏梭菌中的cpaAIR基因，編輯效率高達100%。而相比之下，用Ⅱ型CRISPR-Cas9系統編輯該基因的效率僅為25%。ZHANG等[40]使用丁酸梭菌的內源I-B型CRISPR-Cas系統成功地進行了pyrF和spo0A雙基因敲除，編輯效率為100%。ZHOU等[41]報道了在酪酸梭菌中利用內源I-B型CRISPR-Cas系統進行基因組編輯，成功敲除了spo0A和aldh基因，效率高達100%。這些結果表明內源CRISPR-Cas系統是細菌基因組編輯的有效工具，有巨大的發展潛力。

4 CRISPR-Cas系統在細菌基因轉錄調控中的應用

4.1 CRISPR-dCas9系統介導的基因轉錄調控

雖然已經開發出了對宿主細胞低毒性的CRISPR-Cas9n系統，但在一些DNA修復效率較低且外部修復機制無效的菌株中，Cas9n仍可能導致細胞死亡[42]。所以，科研人員制備了Cas9蛋白HNH核酸酶結構域(H840A)和RuvC核酸酶結構域(D10A)的雙突變體，即滅活核酸內切酶：dCas9。CRISPR-dCas9系統不會引發DNA雙鏈或單鏈的斷裂，可在不引起DNA損傷的前提下識別目標DNA并干擾基因的轉錄[43]。dCas9蛋白既可以與轉錄激活因子融合以產生CRISPR激活(CRISPRa)系統[44]，也可以與特定基因組位點結合從而抑制下游基因的轉錄，在sgRNA的引導下選擇性地調節目標基因的表達，稱為CRISPR抑制(CRISPRi)系統[45]。

傳統的RNA干擾技術可用于下調目標基因表達，但僅限于具有適當宿主機制的特定生物體，并表現出顯著的脫靶效應和細胞毒性[46]。在細菌中，CRISPRi是比RNA干擾更好的基因轉錄調控工具，能有效、可逆地抑制多種細菌中目標基因的表達，如谷氨酸棒桿菌中的pyc、gltA、idsA和glgC[47]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的prtR[48]以及金黃色葡萄球菌的tarO、tarH和tarG[49]。將CRISPR-dCas9系統應用于工業微生物可有效地提高目標產物的產量，如琥珀酸[50]、乙醛酸[51]、白藜蘆醇[52]、1，4-丁二醇[53]等。相比之下，關于細菌CRISPRa的報道則較少。

4.2 CRISPR-ddCpf1介導的基因轉錄調控

由CRISPR-Cas9改造而來的CRISPR-dCas9系統雖然已廣泛應用于基因的轉錄調控，但對于多個靶點需要多個sgRNA的獨立表達。相比之下，采用CRISPR-Cpf1系統則只需設計由19 nt的同向重復序列和23～25 nt的間隔序列組成的crRNA即可實現單基因敲除。更重要的是，將多個crRNA直接串聯，只需要一個啟動子驅動即可簡單高效地實現多基因敲除。而且，crRNA序列的長度比CRISPR-Cas9系統的sgRNA短約60 nt，大大降低了構建系統的難度和成本[3,35]。同時，Cpf1蛋白同時具有DNA內切酶(DNase)和RNA內切酶活性，且DNase失活并不影響RNA內切酶的活性，系統依然能生成成熟的crRNA，靶向識別目標DNA[54]。于是，ZHANG等[55]將Cpf1中的第993位谷氨酸突變為丙氨酸，獲得了DNase失活的DNase-dead Cpf1(ddCpf1)，并將其成功用于大腸桿菌的多位點轉錄調控。LI等[35]開發了基于ddCpf1的CRISPRi系統用于多重基因抑制，在天藍色鏈霉菌中同時抑制了3種抗生素生物合成基因(cpkA、redX、orf1)的表達，效率約為70%。

4.3 內源I-E型CRISPR-Cas系統介導的基因轉錄調控

通過敲除負責降解目標DNA的cas3，大腸桿菌中的內源性I-E型CRISPR-Cas系統被用作可編程基因表達調節器[56]。CHANG等[57]在大腸桿菌中構建了內源I-E型CRISPR-Cas系統，將大腸桿菌中的靶基因表達量下調了82%。TARASAVA等[58]使用改良的內源I-E型CRISPR-Cas系統，可以同時靶向6個不同的基因，通過篩選增加丙二酰輔酶A通量的突變體，提高了大腸桿菌中3-羥基丙酸的產量。

5 總結及展望

自JINEK等[2]于2012年在體外證明了CRISPR-Cas9系統的DNA切割機制后，該系統憑借高效、經濟、簡便等優點逐漸代替了傳統的基因組編輯技術，被廣泛應用于細菌的基因組編輯。結構更簡單的CRISPR-Cpf1系統拓寬了CRISPR-Cas系統的應用范圍并且具有更高地基因組編輯效率。而針對無法引入Cas9和Cpf1的宿主菌，可利用細菌的內源I型CRISPR-Cas系統進行基因組編輯和代謝調控。同時，由于Cas9造成的DSB容易引起細胞死亡，于是在其基礎上開發出了CRISPR-Cas9n系統。另外，對Cas9和Cpf1進行改造得到的dCas9和ddCpf1還可以用于調控基因的轉錄表達。

但CRISPR-Cas系統依然存在改進的空間。首先，CRISPR-Cas系統對PAM位點的特異性識別以及宿主菌對異源蛋白的排斥限制了該系統的應用范圍。因此，未來應努力改造Cas蛋白以擴大其識別范圍并繼續開發內源CRISPR-Cas系統。其次，細菌基因組編輯效率因物種而異，表明宿主菌的生理活動會影響CRISPR-Cas系統。今后應開發更可靠、可誘導和廣泛適用的表達結構，使Cas效應子和gRNA在不同宿主菌中均能穩定表達。最后，隨著CRISPR-Cas系統的大量應用，將生成包含數百萬甚至數十億變體的大型文庫[59]，因此開發高通量技術很有必要，例如高效轉化方法、機器人平臺和微流體系統等。相信隨著科學技術的進步，CRISPR-Cas系統將來會擁有更優異的性能。