基質細胞衍生因子?1α/趨化因子CXC受體4誘導內皮祖細胞血管新生促進腦卒中的神經康復機制

郭丹 張娟 王洪濤 劉行高 郭遠瑾

1華中科技大學協和東西湖醫院（武漢市東西湖區人民醫院）康復醫學科（武漢 430040）；2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院神經內科（武漢 430022）

缺血性腦卒中作為世界上主要的致死性疾病之一，其發病率、死亡率、致殘率和復發率都很高［1］。最近研究發現，盡管大鼠缺血模型急性期存在短暫的血管生成，但嚴重的內皮細胞和基底膜損傷可能是恢復期血管生成的主要有害影響，提示神經血管小生境修復是缺血誘導的卒中的一種策略［2］。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是從骨髓中動員出來的不成熟的內皮細胞，其在維持內皮完整性和內環境穩定方面發揮著重要作用，有利于損傷血管的再內皮化以及缺血組織的血運重建［3］。研究表明，EPCs通過旁分泌或細胞效應在大腦中促進血管生成和神經修復［4］。最近一項蛋白組學研究在長期腦低灌注小鼠模型EPCs分泌組中鑒定了38種蛋白質參與神經血管小生境修復，其中基質細胞衍生因子?1α（stromal cell?derived factor?1α，SDF?1α）具有強信號［信號強度=（159±56.7）］［5］。SDF?1α是中樞神經系統中的一個關鍵調節因子，其通過與受體（CXCRs，如CXCR4或CXCR7）結合在血管生成、炎癥和病理性疼痛中發揮關鍵作用［6］。研究證明，SDF?1α參與協調神經祖細胞的遷移、增殖和分化［7］。因此，本研究假設缺血性腦卒中后EPCs在受損區域積聚并通過SDF?1α/CXCR4或CXCR7軸介導神經血管生成，并采用體外共培養系統和體內缺血缺氧誘導的卒中大鼠模型驗證上述假設。

1 材料與方法

1.1 EPCs制備從本院提供的臍血中分離人EPCs。具體操作為：取新鮮臍血與0.01 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）混合。將混合物小心均勻地倒入淋巴細胞分離培養液（美國Corning公司）上。在1 800×g下離心30 min，仔細提取血漿和分離溶液之間的界面（白色層），并在PBS中以600×g離心10 min。將顆粒重新懸浮并傾倒在分離培養液上，在1 200×g下離心30 min。提取中間相并用EGM2內皮細胞培養液（瑞士LONZA公司）重新懸浮顆粒，將細胞置于25 cm2培養瓶中。

1.2 hBMECs處理人腦微血管內皮細胞（HB?MECs）購自美國Sciencell公司，并在EGM2內皮細胞培養液中培養。為探討氧糖剝奪（oxygen?glu?cose deprivation，OGD）對HBMECs的影響，將細胞分為對照組、OGD 3 h組、OGD 6 h組和OGD 9 h組。當HBMECs在培養皿中60%～70%融合時，用無糖DMEM代替EGM2內皮細胞培養液，在含5%O2和95%N2的培養箱中缺氧0、3、6、9 h。

1.3 缺氧HBMECs條件培養液制備收集HBMECs暴露于OGD 6 h組的培養液，使用帶有10 kDa分子量截留膜的AmiconUltra?15離心過濾器（美國Millipore公司）將培養液離心（4 000×g，15 min）濃縮20倍，然后將培養液通過0.22 mm過濾器（Milli?pore），并在-80℃下儲存。

1.4 檢測EPCs對HBMECs的影響

1.4.1 細胞凋亡檢測將HBMECs分為三組：正常對照組，OGD?HBMECs組（HBMECs暴露于OGD 6 h）和EPCs+OGD?HBMECs組（HBMECs暴露于OGD 6 h，然后與EPCs共培養24 h）。用流式細胞術檢測HBMECs凋亡。消化細胞并在1 000×g下離心5 min。用300 mL結合緩沖液重新懸浮顆粒，然后用5 μL膜聯蛋白V?PE和5 μL 7?AAD（美國BD pharmingen公司）孵育15 min。通過FACS?Can?to?II流式細胞術（美國Becton?Dickinson公司）和FlowJo軟件分析細胞凋亡。

1.4.2 血管生成實驗將EPCs接種到Transwell室中，然后將其插入24孔板中。HBMECs暴露于OGD 6 h后，將反應室移至OGD?HBMECs生長的平板上。將OGD?HBMECs和EPCs在37℃和5%CO2的環境中共培養24 h，然后將HBMECs消化并接種到Matrigel包被的24孔板Transwell小室（美國Corning公司）中。用顯微鏡（日本Olympus公司）觀察血管的形成。

1.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）將內皮細胞分為正常對照組（Ctrl?HBMECs）、OGD 6 h組（OGD?HBMECs）、OGD?HBMECs與EPCs共培養組（OGD?HBMECs+EPCs），和正常內皮細胞與EPCs共培養組（Ctrl?HBMECs+EPCs）。收集培養液并通過ELI?SA試劑盒（美國R&D Systems公司）測量SDF?1α的濃度。

為了進一步研究OGD?HBMECs是否影響EPCs分泌SDF?1α，用SDF?1α shRNA慢病毒（sh?SDF?1α）或對照（sh?NC）（美國Santa Cruz公司）感染EPCs 48 h，然后與OGD?HBMECs共培養24 h，收集培養液，檢測SDF?1α水平。

為了進一步研究CXCR4和CXCR7是否參與OGD?HBMECs凋亡，使用Lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司）將OGD?HBMECs轉染CXCR4或CXCR7小干擾RNA（siRNA）（美國Santa Cruz Bio?technology公司）6 h。與EPCs再孵育24 h后，收集細胞進行凋亡分析。

1.6 Western blot細胞用RIPA裂解緩沖液裂解，并通過BCA法測定蛋白質濃度。用8%～10%十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白裂解液，并轉移到硝化纖維素濾膜上。將膜與5%脫脂奶粉緩沖液孵育1 h，然后與小鼠抗CXCR4（1∶200，美國Santa Cruz公司）和小鼠抗CXCR7（1∶1 000，美國Abcam公司）一級抗體在4℃孵育過夜。在室溫下將膜與山羊抗兔或山羊抗鼠二級抗體（1∶5 000，美國LI?COR公司）在搖床中孵育2 h。最后，采用ECL底物試劑盒（美國Abcam公司）檢測信號，并用Image J軟件進行定量分析。

1.7 大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型建立及治療成年雄性Sprague?Dawley大鼠（年齡10～12周，體質量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［合格證編號：SCXK（京）2016?0006］）用于本實驗。參照文獻方法建立MCAO模型［8］，具體操作為：大鼠通過腹腔注射戊巴比妥（100 mg/kg）誘導麻醉。采用頸部正中切口，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈。從左側頸外動脈向大腦中動脈插入硅膠包裹的尼龍栓線，插入深度約為20 mm。通過使用Moor LAB激光多普勒流量計（英國Moor Instruments公司）檢測表面腦血流，證實了手術的成功。縫合線插入后2 h，再次麻醉大鼠，取出縫合線進行再灌注。在整個造模過程中，有8只大鼠死亡，38只大鼠成功建立MCAO模型，并隨機分為：MCAO模型組（n=9）、MCAO+EPCs組（n=10）、MCAO+缺氧內皮細胞條件培養液預處理EPCs（HBMECs?pEPCs）組（n=10）、MCAO+HBMECs?pEPCs+AMD3100（CXCR4拮抗劑）組（n=9）。假手術組除不插入尼龍栓線外，其余步驟同MCAO組。在MCAO后2 h，一次性向MCAO+EPCs組經尾靜脈注射EPCs（3.0×106細胞/300 μL PBS），MCAO+HBMECs?pEPCs組和MCAO+HB?MECs?pEPCs+AMD3100組經尾靜脈注射HBMECs?pEPCs（3.0×106細胞/300 μL PBS）。模型組和假手術組在注射等體積的PBS。此外，MCAO+HB?MECs?pEPCs+AMD3100組每天腹腔注射AMD 3100（5 μg/kg體質量，10 μg/mL，美國Selleck公司）1次，共2周。

1.8 Morris水迷宮試驗治療后第六周進行Morris水迷宮試驗（每組n=8）。實驗裝置由一個圓形水箱（直徑100 cm，高35 cm）組成，水箱中的水深度為15.5 cm，溫度為（23±1）℃，通過添加黑色無毒碳墨水使其不透明。在水面以下1 cm處設置一個逃逸平臺（直徑4.5 cm，高度14.5 cm）被淹沒，并放置在一個象限的中點。每只大鼠每天接受4次訓練，連續4 d。在第5天，通過移除平臺并讓每只大鼠自由游泳60 s來執行空間搜索測試。分別測量大鼠在目標象限（隱藏平臺訓練期間平臺所在的位置）和三個非目標象限（右象限、左象限和對側象限）游泳的時間。對于空間搜索試驗，還測量和計算了每只大鼠穿過平臺部位的次數。

1.9 免疫熒光染色治療后第7周，依次用PBS和4%冷多聚甲醛心內灌注大鼠（每組4只）。取大腦組織在4%多聚甲醛中固定6 h，然后在4℃的30%蔗糖緩沖液中孵育48 h，然后進行冷凍切片。連續的冠狀切片以5 μm的間隔從Bregma前后軸-2.0 mm到-7.0 mm切割，以收集整個受損皮層。用10%山羊血清和/或0.3%Triton X?100在0.01 mol/L PBS中在37℃下封閉腦切片40 min，然后與Claudin?5（1∶1 000，兔IgG，美國Sigma公司），CD133（1∶100，兔IgG，美國Abcam公司），CD31（1∶100，兔IgG，美國Abcam公司），和vWF（1∶200，小鼠IgG，美國Abcam公司）一級抗體孵育4 h。將切片與山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa?Fluor?488或555結合物（美國Invitrogen公司）二級抗體孵育1 h。最后，將切片與DAPI孵育10 min后在顯微鏡下觀察結果。

1.10 統計學方法所有數據均表示為均值±標準差。使用SPSS 21.0軟件進行統計分析。組間差異采用單因素方差分析（ANOVA）和SNK方差齊性檢驗或Dunnett后驗平方差檢驗進行評價，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EPCs對HBMECs生物活性的影響與OGD 3 h相比，OGD 6 h或9 h的HBMECs凋亡率顯著升高（P<0.05），但OGD 6 h和9 h之間沒有顯著差異（圖1A）。因此，選擇OGD 6 h進行以下實驗。與OGD組相比，EPCs處理導致HBMECs凋亡率顯著降低（P<0.05、圖1B）和血管環數顯著增加（P<0.05、圖1C）。

圖1 EPCs對HBMECs生物活性的影響Fig.1 The effect of EPCs on the biological activity of HBMECs

2.2 EPCs衍生的SDF?1α通過CXCR4而不是CXCR7減輕HBMECs凋亡與OGD?HBMECs組相比，OGD?HBMECs+EPCs培養液中的SDF?1α顯著增加（P<0.05，圖2A）。OGD?HBMECs觸發了EPCs中SDF?1α的產生和分泌，SDF?1α沉默EPCs致上清液中的SDF?1α急劇減少（P<0.05，圖2B）。CXCR7的表達不受EPCs處理的影響；然而，CXCR4的表達在OGD?HBMECs+EPCs處理的細胞中顯著增加（P<0.05，圖2C）。與對照siRNA相比，CXCR4敲除顯著增加HBMECs凋亡（P<0.05，圖2D）。

圖2 EPCs衍生的SDF?1α通過CXCR4而不是CXCR7減輕HBMECs凋亡Fig.2 EPCs?derived SDF?1α attenuates HBMECs apoptosis through CXCR4 but not CXCR7

2.3 MCAO對大鼠大腦皮層中EPCs和SDF?1α表達變化影響MCAO模型大鼠在建模后第4天時大腦皮層中的EPCs數量以及Claudin5陽性血管的平均光密度顯著高于假手術組（P<0.05），但在第10天時降低到正常水平（P<0.05，圖3A?B）。此外，MCAO還導致建模后第4天時大腦皮層中SDF?1α蛋白水平增加（P<0.05），但在第10天時降低到正常水平（P<0.05，圖3C）。

圖3 MCAO對大鼠大腦皮層中EPCs和SDF?1α表達變化影響Fig.3 The effect of MCAO on the expression of EPCs and SDF?1α in rat cerebral cortex

2.4 HBMECs?pEPCs促進MCAO大鼠神經血管小生境修復和改善認知功能與MCAO+EPCs組大鼠相比，HBMECs?pEPCs組大鼠大腦皮層中形成的血管密度增強（P<0.05），但AMD3100治療顯著降低了HBMECs?pEPCs治療形成的血管密度（P<0.05，圖4A中CD31陽性）。采用Morris水迷宮試驗測量認知功能。與MCAO+EPCs組相比，MCAO+HBMECs?pEPCs組大鼠在目標象限的游泳時間和交叉次數顯著增加（P<0.05），但AMD3100治療顯著減弱了HBMECs?pEPCs這一作用（P<0.05，圖4B、C）。

圖4 HBMECs?pEPCs促進MCAO大鼠神經血管小生境修復和改善認知功能Fig.4 HBMECs?pEPCs promoted neurovascular niche repair and improve cognitive function in MCAO rats

3 討論

目前認為，血管生成可以通過恢復血液供應保護細胞免受各種環境壓力，包括缺氧和營養不良，并且在受損組織中發現多種促血管生成因子上調，如VEGFA和ANGPT2［9-12］。此外，還發現血管生成可恢復缺氧或缺血條件下HBMECs功能障礙引起的血管滲漏［13-14］。因此，缺氧應激時促進血管生成被認為是治療卒中的一種有效的神經元保護措施。本研究證明OGD?HBMECs損傷誘導EPCs中SDF?1α的增加，并且EPCs通過SDF?1α/CXCR4軸在體外增強HBMECs的功能和減少HBMECs的凋亡。體內研究的發現進一步支持HBMECs?pEPCs促進MCAO大鼠神經血管小生境修復。

先前的研究表明，EPCs的系統輸送可保護大腦免受缺血性損傷，促進神經血管修復，并改善長期神經行為結果［5］。在EPCs介導的神經保護過程中，趨化因子SDF?1α發揮了關鍵作用［15-17］。SDF?1α通過將循環中的EPCs歸巢到活躍的血管生成部位來介導血管發育［18］。研究表明，SDF?1α可在血清饑餓條件下減弱內皮祖細胞的凋亡，并可防止細胞的衰老，增強受損動脈的再內皮化［19］。本研究發現，EPCs可抑制OGD?HBMECs的凋亡，增強其功能。已有研究表明，EPCs通過分泌BDNF和bFGF促進缺血性腦卒中小鼠血管生成，增加髓鞘厚度。LI等［20］報道，將SDF?1α過度表達的EPCs移植到卒中小鼠體內，可增加血管密度，表明神經血管修復部分依賴于EPCs替代或分泌細胞因子。本研究檢測到由OGD?HBMECs的條件培養液刺激引起EPCs中SDF?1α的明顯增加，并且當OGD?HBMECs和EPC共培養時，CXCR4上調，而CXCR7沒有改變。此外，來自RNAi的數據表明CXCR4在HBMECs中負責SDF?1α依賴性抗凋亡，而不是CXCR7。研究發現，CXCR4受體在HBMECs的增殖和遷移過程中起重要作用，CXCR7可能在成熟過程中起作用。因此，EPCs通過SDF?1α/CXCR4軸介導神經血管生成，維持神經血管小生境穩態。

在成人缺血模型中，體循環中的EPCs被激活并遷移到損傷區域，通過細胞替換整合到新血管中［21-22］。體循環EPCs減少會增加腦損傷和認知障礙的風險。本研究在大鼠MCAO模型大腦皮層中發現EPCs的積聚。EPCs衍生出幾種營養因子，已知SDF?1α、VEGF、血管生成素或MMPs可能負責維持正常和受損大腦中的神經血管小生境微環境穩態［23］。其中，SDF?1α在小鼠腦長期低灌注模型中顯示出改善血管損傷的能力［5］。在缺血性患者中，SDF?1α的表達以及血液中EPCs細胞的數量密切相關［24］。亞急性給予SDF?1α可促進缺血半暗帶血管生成，顯著改善缺血大鼠的神經功能恢復［25］。本研究發現SDF?1α在MCAO大鼠中增加，并且證實它在病理條件下由累積的EPCs釋放，可能有助于神經血管重塑。

總之，這些數據表明EPCs衍生的SDF?1α在內皮祖細胞的發育中發揮了重要作用，提高了EPCs治療缺血性卒中的效果。HBMECs?pEPCs能有效地促進血管生成，其作用機制至少部分由SDF?1α/CXCR4軸介導。此外，HBMECs?pEPCs治療MCAO大鼠的認知功能結果比EPCs治療更明顯。然而，EPCs是否通過其他通路對卒中神經血管重塑和認知功能恢復的影響值得進一步研究。