毛蕊異黃酮對H2O2誘導的氧化損傷的星形膠質細胞增殖和凋亡的影響

許洋 吳成林 郭德華 張國福

1江西中醫藥大學研究生院（南昌 330004）；2江西中醫藥大學附屬醫院創傷骨傷科（南昌 330006）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指由于外傷或病理因素引起脊髓結構與功能損害的神經系統疾病［1］，通常導致感覺和運動功能障礙，嚴重者甚至癱瘓，其致殘率高，對患者的身心健康造成巨大傷害，并給家庭及社會帶來嚴重經濟負擔。盡管傳統的手術及藥物治療能一定程度上改善病情，但仍無法完全恢復脊髓功能，面對如此困境，尋求新的恢復脊髓功能的治療手段仍是當代醫療的重大課題。

SCI分為原發性SCI和繼發性SCI，其中細胞凋亡、氧化損傷和炎癥反應等是導致繼發性SCI的主要因素，其損傷程度遠超原發性損傷［2-3］。研究發現，星形膠質細胞是中樞神經系統最豐富的神經膠質細胞之一，與脊髓神經功能恢復的關系密切［4-5］。毛蕊異黃酮（Calycosin）是一種異黃酮植物雌激素，是從中藥黃芪中提取的有效活性成分之一［6］，具有抗氧化、抗炎癥以及抗腫瘤等作用［7］，并且毛蕊異黃酮可以通過促進NF?κB通路介導的抗氧化途徑對腦損傷發揮神經保護作用［8］。據報道［9-10］，PI3K/Akt信號通路在SCI后脊髓功能恢復中起重要作用，并參與炎癥反應、神經膠質瘢痕形成、細胞增殖和凋亡。而目前毛蕊異黃酮對星形膠質細胞的影響及作用機制尚未明確，有待進一步研究。筆者猜想毛蕊異黃酮可以通過PI3K/Akt信號通路對星形膠質細胞產生影響，故本研究將基于該通路探討毛蕊異黃酮苷對氧化損傷的星形膠質細胞增殖和凋亡的影響，并進一步闡明其可能作用機制，進而為治療脊髓損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級新生24 h雌性SD乳鼠10只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養于江西中醫藥大學實驗動物科技中心，飼養于潔凈環境中。實驗過程中對動物的處理嚴格依照國家對醫學實驗動物的相關要求進行。

1.2 細胞及培養將SD乳鼠，用75%的酒精泡3 min左右，將其俯臥于無菌操作臺中，剪開其背部皮膚，鈍性分離背部肌肉，分離脊柱剖開椎管取脊髓，體視鏡下去除包膜，剪碎組織，在0.25%胰蛋白酶中37℃中消化10～15 min左右后用完全培養基終止消化。用吸管輕柔吹散，過濾網，1 000 r/min離心5 min收集細胞，接種培養至培養瓶中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養40 min后輕搖培養瓶，去除貼壁的成纖維收集未貼壁的細胞上液，1 000 r/min離心5 min收集細胞加入完全培養基培養。

1.3 主要試劑與儀器毛蕊異黃酮（上海基屹生物科技有限公司）；PBS、CCK?8法細胞增殖檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；Rabbit Anti IL?6（北京博奧森生物技術有限公司）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Rabbit Anti p?AKT、Rabbit Anti gp130（安諾倫生物科技有限公司）；超高靈敏度化學發光成像系統（伯樂生命醫學產品上海有限公司）；全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）；旋渦混合器（常州越新儀器制造有限公司）；全自動酶標（北京六一生物科技）；流式細胞儀（艾森生物杭州有限公司）。

1.4 毛蕊異黃酮濃度的篩選用不同濃度的毛蕊異黃酮（5、10、20 μmol/L）預處理星形膠質細胞12 h，然后用100 μmol/L的H2O2處理24 h造成氧化損傷。用CCK8檢測各組細胞增殖情況篩選合適的毛蕊異黃酮處理濃度。

1.5 實驗分組及給藥將實驗分為對照組、H2O2（100 μmol/L）模型組、H2O2（100 μmol/L）+毛蕊異黃酮（20 μmol/L）干預組，按照實驗分組先用毛蕊異黃酮預處理24 h后進行造模處理24 h，之后加抑制劑處理24 h后進行CCK8檢測。

1.6 CCK8檢測將造模后的細胞換成新鮮培養基，每孔100 μL，每孔加入10 μL的CCK8試劑，置于培養箱中孵育2 h，酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光值。

1.7 免疫熒光檢測在培養板中將已爬好細胞的培養皿用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養皿3次，每次3 min；0.5%Triton X?100（PBS配制）室溫通透20 min。PBS浸洗培養皿3次，每次5 min，移液槍吸干PBS，在培養皿內滴加5% BSA，37℃封閉30 min。移液槍吸掉封閉液，不洗，培養皿內滴加足夠量的稀釋好的一抗Brdu（1∶200），37℃孵育3 h。PBS浸洗培養皿3次，每次3 min，移液槍吸干培養皿內多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Cy3（1∶200），37℃孵育45 min，PBS浸洗培養皿3次，每次3 min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，用PBS沖洗多余的DAPI；用50%甘油封閉培養皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.8 流式細胞檢測細胞凋亡情況收集1×106～3×106個細胞，加1 mL PBS 1 500 r/min離心3 min，洗兩遍，用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer，取300 μL預冷的1×Binding Buffer重懸細胞。每管各加入3 μL Annexin V?FITC和5 μL PI?PE。輕微混勻后，室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μL預冷的1×Binding Buffer。混勻后上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.9 Western blot法檢測相關蛋白表達取各組樣本獲取總蛋白，根據BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉膜30～50 min。一抗溶液孵育，4℃過夜；二抗溶液中室溫孵育1～2 h。用ECL液顯色，Image J軟件觀察條帶灰度值并計算蛋白表達。

1.10 統計學方法采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。所有實驗均重復3次以上，計量資料用（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 毛蕊異黃酮濃度的篩選H2O2顯著降低了細胞的增殖活力，在不同濃度毛蕊異黃酮干預下，各組星形膠質細胞的增殖活力均增強，毛蕊異黃酮濃度在20 μmol/L時，星形膠質細胞的增殖活力顯著增強（P<0.05），故選擇20 μmol/L繼續后續實驗。見圖1。

圖1 不同濃度的毛蕊異黃酮對星形膠質細胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Calycosin on astrocytes proliferation

2.2 毛蕊異黃酮對氧化損傷的星形膠質細胞增殖的影響和對照組相比，在H2O2誘導星形膠質細胞氧化損傷24h后，星形膠質細胞的增殖活力明顯下降（P<0.05），而毛蕊異黃酮能顯著增強星形膠質細胞的增殖活力（P<0.05）。見圖2。

圖2 毛蕊異黃酮對星形膠質細胞增殖的影響Fig.2 Effect of Calycosin on proliferation of astrocytes

Brdu免疫熒光結果顯示，與對照組相比，H2O2抑制了星形膠質細胞的增殖（P<0.05），而毛蕊異黃酮能明顯增強星形膠質細胞增殖。見圖3。

圖3 Brdu免疫熒光檢測結果Fig.3 BrdU immunofluorescence test results

2.3 毛蕊異黃酮對氧化損傷的星形膠質細胞凋亡的影響與對照組相比，H2O2組星形膠質細胞凋亡率顯著上升，與H2O2組相比，毛蕊異黃酮組的星形膠質細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），明顯抑制了星形膠質細胞凋亡。見圖4。

圖4 流式細胞術星形膠質細胞的凋亡率Fig.4 Apoptosis rate of astrocytes by flow cytometry

2.4 毛蕊異黃酮對PI3K/Akt信號通路相關蛋白的影響與對照組相比，H2O2組的GP130、IL?6、p?AKT的蛋白表達水平顯著增加（P<0.05），與H2O2組相比，毛蕊異黃酮能顯著抑制GP130、IL?6、p?AKT蛋白表達（P<0.05）。見表1及圖5。

圖5 毛蕊異黃酮對星形膠質細胞的p?AKT、GP130、IL?6蛋白表達水平的影響Fig.5 Effects of Calycosin on the expression levels of p?Akt，gp130 and IL?6 proteins in astrocytes

表1 各組GP130、IL?6、p?AKT蛋白表達Tab.1 Expression of GP130，IL?6，p?AKT protein in each group ±s

表1 各組GP130、IL?6、p?AKT蛋白表達Tab.1 Expression of GP130，IL?6，p?AKT protein in each group ±s

注：*P<0.05，與Control組相比；#P<0.05，與H2O2組相比

組別Control H2O2 H2O2+calycosin F值P值GP130 0.133±0.010 1.268±0.221*0.351±0.087*#57.951<0.01 IL?6 0.448±0.195 1.565±0.286*0.491±0.370*#14.052<0.01 p?AKT 0.510±0.172 1.242±0.326*0.439±0.029*#12.995<0.01

3 討論

在脊髓損傷發生后，會產生一系列復雜的病理學反應，對脊髓造成進一步的繼發性損傷。盡管SCI的病因和發病機制仍有待充分了解，但多項研究證實神經星形膠質細胞在SCI的病理生理學中具有重要作用［11-13］，減輕星形膠質細胞的氧化損傷是干預脊髓功能恢復的有效策略［14］。毛蕊異黃酮作為中藥黃芪中提取的有效活性成分之一，其抗氧化、抗炎和對神經的保護作用顯著。但目前仍缺乏毛蕊異黃酮對星形膠質細胞的作用及影響的研究，需要進行更多的研究佐證。因此，本實驗通過毛蕊異黃酮對氧化損傷的星形膠質細胞的干預，分析其對星形膠質細胞增殖和凋亡的影響，并探究其可能機制，為脊髓功能恢復尋求新的治療手段。

氧化應激是由過氧化氫（H2O2）等活性氧（ROS）的積累引起的［15］，與SCI、腦缺血和神經退行性疾病等多種神經系統疾病的病因有關［16-17］，前期研究發現，氧化應激會誘導星形膠質細胞凋亡，且實驗中常用H2O2誘導星形膠質細胞氧化損傷建立模型［18-20］。本實驗研究先通過不同濃度毛蕊異黃酮對星形膠質細胞干預，再使用H2O2誘導星形膠質細胞造成氧化損傷，結果發現H2O2降低了細胞的增殖活力，20 μmol/L的毛蕊異黃酮濃度顯著增強了細胞的增殖活力（P<0.05），故選用該濃度進行后續研究。流式細胞術結果顯示H2O2使星形膠質細胞凋亡率升高，而毛蕊異黃酮顯著抑制了星形膠質細胞凋亡，初步證明毛蕊異黃酮對氧化損傷的星形膠質細胞具有保護作用，可以增強其增殖活力并抑制凋亡。

在星形膠質細胞凋亡和增殖的機制研究中，PI3K/Akt信號通路一直是該研究的熱點。日本路邊青可以通過BDNF/PI3K/Akt/CREB途徑促進星形膠質細胞增殖，并抑制凋亡［21］；而Annexin?A1卻通過PI3K/AKT信號通路抑制了神經膠質細胞和膠質瘤細胞的增殖和遷移［22］，這表明PI3K/AKT信號通路在星形膠質細胞凋亡和增殖機制中起重要作用。另一方面，研究證實毛蕊異黃酮可以通過PI3K/AKT信號通路對細胞炎癥、凋亡與增殖產生作用［23-24］。在ZEGEYE等［25］的報道中證實IL?6可以激活PI3K/AKT信號通路，IL?6的主要β受體是GP130，其在星形膠質細胞中也有表達，并且PI3K/AKT信號通路正是位于IL?6細胞因子共用信號傳導亞單位GP130下游的信號通路［26］。當細胞損傷后，PI3K/Akt信號通路會被異常激活，其表達迅速升高，可磷酸化磷脂酰肌醇，生成磷酸化PI3K（p?PI3K），在p?PI3K的作用下又可引起AKT磷酸化，形成磷酸化AKT（p?AKT）。因此，磷酸化AKT（p?AKT）可作為衡量PI3K活性的指標。本研究結果顯示：氧化損傷的星形膠質細胞GP130、IL?6、p?AKT等蛋白表達顯著高于正常星形膠質細胞（P<0.05）；而毛蕊異黃酮能顯著下調H2O2誘導氧化損傷后GP130、IL?6、p?AKT蛋白的表達（P<0.05）。以上結果表明毛蕊異黃酮能有效抑制炎癥反應，促進H2O2誘導的氧化損傷的星形膠質細胞增殖并抑制其凋亡，其作用機制與抑制PI3K/Akt信號通路磷酸化有關。

綜上所述，毛蕊異黃酮可以通過抑制PI3K/Akt信號通路磷酸化促進氧化損傷的星形膠質細胞的增殖，并抑制其凋亡。本研究豐富了中藥（毛蕊異黃酮）對星形膠質細胞作用的研究，有一定參考意義。但在細胞凋亡與增殖過程中可能涉及到多條信號通路的參與，本實驗中僅設計PI3K/Akt一條信號通路的研究，存在一定局限性，未來應對其他相關信號通路進行研究，不斷完善星形膠質細胞具體機制的研究，為治療脊髓損傷提供新的臨床研究依據。