一株椰毒假單胞菌酵米面亞種在培養基中的生長規律和產毒研究

嚴瓊英，李樂詩，孫鈺涵，林澤宇，羅爾倫，陳 晶

（深圳市計量質量檢測研究院，廣東深圳 518131）

椰毒假單胞菌酵米面亞種（Pseudomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans）是 1977年 中國學者在東北酵米面中毒事件中發現的食物中毒菌[1]，可產生毒黃素（Toxoflavin，TF）和米酵菌酸（Bongkrekic Acid，BA），能引起高致死性的食物中毒。據文獻[2]報道，發病率可高達96%，病死率高，是迄今為止我國發現的發病率和死亡率極高的食源性致病菌。該菌具有與其他細菌不同的產毒特點，可產生外毒素米酵菌酸，在相同條件下，米酵菌酸產量比毒黃素大，毒性比毒黃素強[3]。

研究發現米酵菌酸是一種具有較強生物活性的毒素，隨污染的食物進入人體后可引起惡心、嘔吐、腹脹、腹痛等，嚴重者出現黃疸、腹水、皮下出血、驚厥、血尿、血便等肝腦腎實質性器官損害癥狀[4-6]。近幾年，我國發生過多起食用含有米酵菌酸的食品導致中毒死亡的事件。例如，2012年山東省臨沂市，2014年云南省文山州，2018年廣東省東莞市，2020年黑龍江省均發生過食用被米酵菌酸污染的食品導致的中毒死亡事件[7-9]。

椰毒假單胞菌酵米面亞種適宜生長溫度為26～37 ℃[10]，且該菌代謝多樣性豐富，對碳源要求不高，在有任一可利用的有機化合物存在下即可生長繁殖，在適宜的溫度和濕度條件下，短時間內可產生大量毒素[11]。孟昭赫等[12]采用正交設計法研究了實驗條件下影響椰毒假單胞菌酵米面亞種的產毒能力情況，發現對產毒能力的影響程度大小依次為菌株、培養基、溫度、pH值、培養時間，且最適產毒溫度為26～28 ℃。黃偉峰等[13]研究椰毒假單胞菌酵米面亞種的選擇性培養基時涂布接種血瓊脂平板作為對照培養基進行生長率試驗。汪廷彩等[14]文獻報告該菌在生長過程可形成生物膜，定植于基質表面。此特性可能是GB 4789.29—2020中采用PDA半固體表面接種培養法獲得菌株的代謝產物米酵菌酸的原因之一。國標中的產毒培養需要至少6 d，且培養物需冰凍過夜和過濾才得到毒素粗提液，操作復雜，耗時長。

目前針對椰毒假單胞菌酵米面亞種菌株在培養基中的生長規律和產毒情況研究較少，項目組將實驗室分離到的椰毒假單胞菌酵米面亞種菌株接種到PD水培養基中，通過考察不同初始染菌量、不同溫度（4 ℃、26 ℃、36 ℃）培養下的測定菌液濃度和米酵菌酸濃度，以及考察靜置和振蕩不同培養方式下測定培養物中米酵菌酸濃度的方法，研究椰毒假單胞菌酵米面亞種的生長規律與產毒情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

椰毒假單胞菌酵米面亞種（本實驗室編號為83756），為實驗室按GB 4789.29—2020方法分離，VITEK 2 Compact全自動生化鑒定系統生化鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌，經GB 4789.29—2020方法產毒培養后采用《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》（GB 5009.189—2016）方法檢出米酵菌酸。

1.1.2 主要試劑

血瓊脂平板（鄭州安圖生物工程有限公司）；馬鈴薯葡萄糖水（PD水）（青島海博）；米酵菌酸標準品（純度96.9%，濃度1 mg·mL-1，安譜）；甲醇和乙腈（HPLC 級，德國 Merck 公司）；甲酸（HPLC 級，德國CNW 公司）；氨水（分析純，廣州化學試劑廠）；色譜柱（Agilent TC C18250 mm×4.6 mm，Agilent 公司）；超純水（18.2 MΩ·cm，實驗室Milli-Q 自制）。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（Ultimate 3000型，德國賽默飛世爾）；生化培養箱（SHP-250型，上海精宏）；冷藏箱（HYC-390型，海爾）；電熱恒溫培養箱（INE600型，德國 Memmert）；比濁儀（Densimat型，法國生物梅里埃）；恒溫培養振蕩器（HZP-250，上海精宏）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗用菌株培養物制備

將椰毒假單胞菌酵米面亞種83756株接種于血平板 37 ℃ 培養 24 h。

1.3.2 PD水靜置培養菌株生長規律和產毒變化實驗

挑取1.1.2血平板培養物制備0.5麥氏濁度的菌懸液，經10倍系列稀釋獲得102、104、106CFU·mL-1數量級菌液作為初始污染菌液量，并將10-5和10-6稀釋度菌液涂布血瓊脂平板進行計數，確定接種量，以下用低、中、高濃度菌液分別代表3個數量級的菌液。同時各取1 mL菌液接種于100 mL PD水中，分為3組，分別放置于不同溫度（4 ℃、26 ℃、36 ℃）下靜置培養。

每 12 h （培養 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）取出不同培養溫度的3組培養物，取1 mL加入9 mL生理鹽水稀釋液中進行10倍系列稀釋，選合適的2個連續梯度取0.1 mL涂布血瓊脂平板，36 ℃培養48 h并計數，同時取10 g培養物按GB 5009.189—2016進行BA濃度檢測。

1.3.3 PD水靜置、振蕩培養產毒變化實驗

將約108CFU·mL-1濃度菌液作為初始污染菌液量分別取1 mL加到PD水中，分兩組，一組放置于36 ℃靜置培養，另一組放置于36 ℃搖床150 r·min-1振蕩培養，于24 h、48 h、72 h 3個時間點取出，取10 g培養物按GB 5009.189—2016測定其米酵菌酸濃度。

2 結果與分析

2.1 PD水靜置培養菌株生長規律及產毒變化

2.1.1 4 ℃培養菌株的生長規律及產毒變化

低、中、高3個初始濃度的菌液在4 ℃下培養72 h內，各時間點PD水均呈澄清狀態；對培養物進行菌落計數，如表1所示，菌液濃度在72 h內均在相應初始菌液的同一數量級，表明該菌在4 ℃基本停滯生長。低、中、高濃度初始菌液的PD水培養72 h，其培養液中未檢出米酵菌酸，檢出限為 5 μg·kg-1。

表1 4 ℃培養液中米酵菌酸濃度和菌液濃度變化

2.1.2 26 ℃培養菌株的生長規律及產毒變化

如圖1所示，低、中兩個初始濃度菌液的培養液在26 ℃下培養，菌株在培養的第24 h開始菌液濃度有明顯增長，在72 h的培養過程中菌落數可達到108CFU·mL-1；但整個培養過程中未檢測到米酵菌酸。在高濃度初始菌液的PD水中，菌落濃度值在107～108CFU·mL-1，可檢測到少量的米酵菌酸，濃度范圍為 5.48 ～ 6.72 μg·kg-1。

2.1.3 36 ℃培養菌株的生長規律及產毒變化

如圖2所示，低、中、高3個初始濃度菌液在36 ℃下培養72 h內，菌株83756均生長迅速，每個濃度的初始菌液在培養24 h后都能產生米酵菌酸。低濃度初始菌液的PD水中培養至72 h的過程中，米酵菌酸的濃度較低，為5.04～7.23 μg·kg-1；中、高濃度初始菌液的PD水在培養過程中，在60 h后，米酵菌酸增長了40多倍，為242 ～ 354 μg·kg-1。

2.2 不同培養方式產毒變化情況

表2的實驗數據顯示，36 ℃培養72 h內，菌株在PD水中靜置培養，培養液中米酵菌酸的濃度最高才達到149.8 μg·kg-1。當改變為振蕩培養方式時，菌株產生的米酵菌酸迅速增多，24 h、48 h、72 h這3個時間段米酵菌酸數值均為靜置培養時的20多倍，說明用液體培養基培養時，振蕩培養方式更有利于椰毒假單胞菌酵米面亞種產生米酵菌酸，且產毒量比靜置培養高出20倍以上。

表2 菌株在不同培養方式下產毒能力比較

3 結論與討論

本次生長規律實驗中，培養溫度對菌株83756的生長影響顯著。4 ℃培養72 h，3個初始濃度的菌液基本處于生長停滯的狀態，而在26 ℃、36 ℃培養72 h，PD水中菌株快速生長，說明了該菌在4 ℃條件下不生長繁殖，但也沒有出現明顯的凋亡現象，且最佳培養溫度為26～36 ℃。

本次產毒規律實驗中，培養溫度、初始菌液量、培養方式（是否振蕩）可影響菌株83756的產毒能力，主要體現在以下3方面。①培養溫度。4 ℃條件下，不論初始菌液濃度高低，均不利于菌株產毒。隨著溫度的升高和初始菌液濃度的增加，菌株83756的產毒能力逐漸增強。靜置培養過程中，36 ℃培養至72 h，3個初始菌液濃度培養物產生的米酵菌酸濃度均比4 ℃、26 ℃的高，表明這株菌的最適產毒溫度為36 ℃，菌株對產毒條件的影響較大。②初始菌液量。36 ℃靜置培養過程中，低、中、高濃度初始菌液培養物在60 h時濃度均達到108CFU·mL-1，但低濃度初始菌液培養物產生的米酵菌酸濃度卻比中、高濃度下產生的低了40多倍。說明在72 h內，低濃度初始菌液在PD水靜置培養中產毒能力較低，初始菌液濃度越高，產毒能力越強。③培養方式。該菌株在PD水中36 ℃采用振蕩培養方式培養產生的米酵菌酸迅速增多，比靜置培養高出20多倍。項目組分析，椰毒假單胞菌酵米面亞種產毒過程對氧氣的依賴性較強，靜置培養至48 h后，PD水中的氧氣消耗快速，氧氣通過空氣擴散補給速度較慢，產毒能力受限。采用振蕩培養方式，可以有效增大氧氣供給方式，使產毒菌株產毒能力明顯增大。

本實驗研究中，PD水液體培養基振蕩培養法比靜置法更有利于椰毒假單胞菌酵米面亞種產生米酵菌酸，相比國家標準GB 4789.29—2020的產毒培養，前者操作簡單，更容易獲得毒液提取液進行米酵菌酸測定，為未來進一步優化現有國標產毒培養方法提供了方向。