利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制Rc基因恢復(fù)紅稻

張?jiān)?尹麗穎 李榮田,* 何明良 劉欣欣 潘婷婷 田曉杰 卜慶云 李秀峰,*

利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制基因恢復(fù)紅稻

張?jiān)?尹麗穎1李榮田1,*何明良2劉欣欣3潘婷婷4田曉杰2卜慶云2李秀峰2,*

（1黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150080；2中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 哈爾濱 150081;3東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；4黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 黑龍江 大慶 163319;*通信聯(lián)系人, email: lirongtian07@aliyun.com; lixiufeng@iga.ac.cn）

【目的】將栽培稻品種恢復(fù)為米質(zhì)優(yōu)、抗逆性強(qiáng)的紅稻具有較大的研究價(jià)值。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，編輯原花青素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因，恢復(fù)紅種皮特性，以改良水稻米質(zhì)，提升抗逆性。【方法】利用CRISPR/Cas9技術(shù)，以為靶基因，構(gòu)建突變載體pYLCRISPR/Cas9--gRNA，以空育180、上育453為材料，轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過測(cè)序手段和表型觀察驗(yàn)證成果?！窘Y(jié)果】分子水平檢測(cè)獲得突變材料2種，其中KY-1在1414―1417 bp缺失4個(gè)堿基，終止子突變?yōu)楸奖彼幔籗Y-1在1411 bp處缺失1個(gè)堿基，終止子突變?yōu)樘於彼帷?種編輯材料均恢復(fù)為紅米表型，且具有一定耐鹽堿能力?！窘Y(jié)論】利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功獲得恢復(fù)紅種皮表型的純合株系，為紅米改良提供基礎(chǔ)材料。

水稻；；紅種皮；耐鹽堿；CRISPR/Cas9

隨著我國國民生活水平的不斷提高，人們關(guān)于健康飲食方面的意識(shí)不斷增強(qiáng)[1]。作為主要糧食作物的水稻，民眾的關(guān)注度不再滿足于其產(chǎn)量，對(duì)品質(zhì)的要求逐步提高，特種稻米的市場需求增加[2]。特種稻米分為色稻、香稻和專用稻。紅米作為有色稻米的一種，屬于特種稻米[3]。我國擁有較為豐富的有色稻米種質(zhì)，占水稻資源總體的10%，其中紅米種質(zhì)有8963份[4]。有色稻米相較于普通稻米（白米），蘊(yùn)含豐富的微量元素和營養(yǎng)物質(zhì)，擁有廣泛的市場[5]，因而挖掘和創(chuàng)制紅米種質(zhì)尤為重要。

世界上絕大部分種植水稻種皮顏色為白色[6]，主要由和兩對(duì)等位基因控制稻米紅色種皮性狀[7]。在馴化過程中，調(diào)控水稻種皮顏色的原花青素轉(zhuǎn)錄因子基因，在第6外顯子后出現(xiàn)14 bp的堿基缺失[8]，造成移碼突變，提前出現(xiàn)終止子，使得后續(xù)的bHLH結(jié)構(gòu)域缺失，基因不能完整表達(dá)，種皮為白色；當(dāng)與基因同時(shí)存在時(shí)，種皮為紅色；當(dāng)基因單獨(dú)存在時(shí)，表現(xiàn)為棕色或棕色伴隨深色斑點(diǎn)；當(dāng)基因單獨(dú)存在時(shí)，種皮表現(xiàn)為白色[9]。在世界范圍內(nèi)，雜草稻是稻田系統(tǒng)中難以根除的一種競爭性雜草，形態(tài)特征介于野生稻和栽培稻之間[10]，大多數(shù)雜草稻種皮顏色為紅色[11]，具有生長周期短、谷殼顏色深、耐脅迫能力強(qiáng)[12]等特點(diǎn)，因而在恢復(fù)紅米表型后，有望恢復(fù)部分雜草稻的耐脅迫能力，如耐鹽堿能力。

現(xiàn)今，CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種非常成熟的基因編輯技術(shù)，因其簡單高效被廣泛應(yīng)用于植物分子育種當(dāng)中[13]，在水稻[14]、玉米[15]、大豆[16]等糧食作物中均有應(yīng)用，特別是在水稻中，研究者采用該技術(shù)對(duì)粒型[17]、香味[18]、直鏈淀粉含量[19]等多個(gè)性狀進(jìn)行了改良，為進(jìn)一步推廣特種稻米的優(yōu)良種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。目前，傳統(tǒng)育種仍是紅米培育的主要方式，紅稻8號(hào)[20]、清紅優(yōu)1號(hào)[21]等具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的紅米品種，均為通過傳統(tǒng)育種方式培育而成。隨著分子技術(shù)的革新，研究者已將調(diào)控紅米性狀的基因逐步定位[22]，并加以克隆，Zhu等[23]通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功恢復(fù)了白米材料的紅米表型。因而，本研究試圖應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、耐倒伏的優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)紅色種皮。

本研究選擇日本優(yōu)質(zhì)早粳稻上育453和空育180（均為空育131的姊妹系）作為試驗(yàn)材料，這兩個(gè)品種具有圓粒型、結(jié)實(shí)率高、抗倒伏及耐寒性強(qiáng)等優(yōu)質(zhì)特性，適宜北方寒地種植，改變其米色具有較大的應(yīng)用推廣前景。利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在基因終止子前進(jìn)行基因編輯，定向突變基因第6外顯子1407 bp附近的堿基序列，使得該位點(diǎn)附近堿基缺失，產(chǎn)生移碼突變，剔除終止子，恢復(fù)原始氨基酸序列，將第474位終止子變?yōu)楸奖彼峄蛱於彼?，bHLH結(jié)構(gòu)域得以正常表達(dá)，使其表現(xiàn)出紅米性狀，耐脅迫能力提高，為深入開展紅米品種改良工作奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以適宜寒地種植的日本優(yōu)質(zhì)早粳稻上育453和空育180為試驗(yàn)材料，獲得基因編輯材料。所有材料在哈爾濱的室外，以25 cm×25 cm的間距種植于盆栽盒，自然長日照條件下生長。

pYL-U6a-gRNA和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H雙元載體[24]由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士惠贈(zèng)。

1.2 CRISPR/Cas9靶點(diǎn)接頭設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得（LOC_Os07g11020）的基因序列，利用CRISPR-GE在線網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/），在第6外顯子（圖1）設(shè)計(jì)2對(duì)靶點(diǎn)接頭引物CAS9-Rc1/2-LP/RP（表1），利用CRISPR Primer Designer軟件，進(jìn)行水稻全基因組序列比對(duì)，檢測(cè)靶點(diǎn)特異性，排除潛在脫靶序列。

參照Ma等[25]的方法進(jìn)行載體構(gòu)建，將連接好的載體通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Match1-T1中，菌液PCR檢測(cè)后，保存菌液。把菌液送至庫美生物有限公司，利用測(cè)序公共引物M13-F測(cè)序，測(cè)序成功后將返還的質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。

1.3 T0代陽性植株的獲得

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入日本優(yōu)質(zhì)早粳稻上育453、空育180的愈傷組織中，經(jīng)過潮霉素篩選抗性愈傷組織，分化獲得T0植株。將T0植株種植于室外盆栽盒中，對(duì)每株T0代植株提取葉片的全基因組DNA，通過引物HPT-F/R(表1)進(jìn)行PCR檢測(cè)，產(chǎn)物大小為900 bp的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株，并收獲種子用于下一代種植。

1.4 T1代純合突變植株的篩選

在T0代收獲的種子中，挑選粒型飽滿且剝殼后種皮為紅色的種子，室溫下浸種1 d，37℃下催芽2 d，育秧后種植于室外盆栽盒中。在苗期提取T1代植株基因組DNA，利用測(cè)序引物Rc-F/R（序列列于表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送去庫美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，選擇測(cè)序成功的植株收獲種子繼續(xù)加代。

1.5 T2代植株耐鹽堿能力分析

依據(jù)測(cè)序結(jié)果，選擇紅種皮種子分別進(jìn)行芽期耐鹽堿實(shí)驗(yàn)。選擇顆粒飽滿的種子剝皮后，室溫浸種1 d，37℃下催芽2 d，選取出芽一致的種子播種于裝有發(fā)芽紙的培養(yǎng)皿中，分別加0、30、100、200 mmol/L NaCl溶液，每2～3 d測(cè)量一次芽長，挑選表型差異較大處理的植株，使用試劑盒提取葉片RNA，根據(jù)前人研究選擇3個(gè)上調(diào)的耐鹽標(biāo)記基因（[26]、[27]、[28]，表1），qRT-PCR鑒定表達(dá)量。另選取發(fā)芽一致的種子播種于裝有發(fā)芽紙的平皿中，分別加0、20、40 mmol/L Na2CO3溶液，每2～3 d測(cè)量一次芽長，挑選表型差異較大處理的植株，使用試劑盒提取葉片RNA，根據(jù)前人研究選擇3個(gè)上調(diào)的耐堿標(biāo)記基因（[29]、[30]、[31]，表1），qRT-PCR鑒定表達(dá)量。同時(shí)選取正常生長、20 mmol/L Na2CO3處理、200 mmol/L NaCl處理下的各組材料RNA，以qRT-PCR鑒定表達(dá)量（表1）。

黑色序列為靶點(diǎn)序列，灰色下劃線序列為PAM序列。

Fig. 1. Gene structure and target site of

表1 本研究中所用的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 T0代轉(zhuǎn)基因陽性苗檢測(cè)

白種皮水稻基因編碼區(qū)序列全長為1483 bp，編碼473個(gè)氨基酸，根據(jù)軟件預(yù)測(cè)，在終止子前25 bp內(nèi)，尋找合適PAM位點(diǎn)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除部分堿基，產(chǎn)生移碼突變，去除終止子，恢復(fù)bHLH結(jié)構(gòu)域，即恢復(fù)完整基因功能。據(jù)此設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)引物（圖1），構(gòu)建Cas9-Rc載體，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染上育453、空育180的愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株T0代，對(duì)獲得的14株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行潮霉素鑒定，其中13株為陽性植株，1株為陰性植株，陽性率為92.85%（圖2），將陽性植株種植于室外的盆栽盒中，收取種子。

2.2 T1代植株表型及突變類型鑒定

將T0代收獲的種子剝殼處理，觀察是否恢復(fù)紅米表型。在收獲的13個(gè)株系中，有2個(gè)株系的種皮表型變?yōu)榧t色，其中空育180背景有1株，命名為KY-1，上育453背景有1株，命名為SY-1，可明顯觀察到紅米表型變化（圖3-A）。

測(cè)序發(fā)現(xiàn)，KY-1在1414―1417 bp處缺失4個(gè)堿基（CCAA），導(dǎo)致第472位脯氨酸（Pro）、第473位精氨酸（Arg）、第474位終止子分別突變?yōu)楦拾彼幔℅ly）、天冬氨酸（Asp）、苯丙氨酸（Phe）；SY-1在1411 bp處缺失1個(gè)堿基（C），導(dǎo)致第472位脯氨酸（Pro）、第473位精氨酸（Arg）、第474位終止子分別突變?yōu)楣劝滨０罚℅ln）、甘氨酸（Gly）、天冬氨酸（Asp）（圖3）。相較于正常表達(dá)的基因，KY-1、SY-1在bHLH結(jié)構(gòu)域前缺失多個(gè)氨基酸，其中KY-1在471-476位缺失6個(gè)氨基酸，且存在T470C、Q477H的突變；SY-1在471―475位缺失5個(gè)氨基酸，且存在T470C的突變，但二者bHLH結(jié)構(gòu)域均無變化（圖3-D），能夠正常表達(dá)。兩種類型的突變均可以使得白米氨基酸序列第474位終止子提前解除，恢復(fù)bHLH結(jié)構(gòu)域的表達(dá)及紅米的表型。

M―DM2000 DNA 標(biāo)記; 1～14―T0代植株; 15―陽性對(duì)照; 16―陰性對(duì)照。

Fig. 2. Transgenic detection of T0generation plants.

A―紅米性狀恢復(fù)株系與野生型表型對(duì)比（標(biāo)尺=1 cm）；B―紅米性狀恢復(fù)株系與野生型堿基序列比對(duì)；C―紅米性狀恢復(fù)株系與野生型氨基酸序列比對(duì); D―紅米性狀恢復(fù)株系與野生型bHLH結(jié)構(gòu)域比對(duì)（紅框內(nèi)為bHLH結(jié)構(gòu)域）。

Fig. 3. Phenotype and sequencing identification of T1transgenic plants.

2.3 T2代植株抗性分析

用0 mmol/L NaCl處理，紅米株系SY-1于4 d后表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長能力；在其他濃度下，0～4 d內(nèi)，SY-1并未表現(xiàn)出突出的生長能力，而后逐漸超過野生型及其他株系（圖4-A～D）。在200 mmol/L NaCl處理下，SY-1相較于其他材料表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽能力（圖4-D）。以空育180為背景的KY-1，僅在30 mmol/L NaCl處理下，表現(xiàn)出一定的耐鹽堿能力（圖4-B）。

在SY-1中，三種標(biāo)記基因、、的表達(dá)水平，與野生型相比均有顯著提高（圖5-A～C），與表型差異相符（圖4-G）；而在KY-1中，、的表達(dá)水平相較于野生型無明顯差異，僅的表達(dá)量有所升高（圖5），與其基因編輯株系的弱耐鹽能力表型一致（圖4-G）。

在20 mmol/LNa2CO3處理下，7 d后紅米株系SY-1表現(xiàn)出較為突出的生長能力，KY-1與野生型差異不大（圖4-E）；在40 mmol/LNa2CO3的處理下，各株系雖表現(xiàn)出不同的生長趨勢(shì)，但差異并不顯著（圖4-F），因而選擇20 mmol/LNa2CO3處理下的野生型、KY-1、SY-1植株提取RNA進(jìn)行表達(dá)量鑒定，發(fā)現(xiàn)三種耐堿標(biāo)記基因、、的表達(dá)趨勢(shì)各不相同，但相較于野生型，KY-1、SY-1的表達(dá)水平均有所升高（圖5-D～F）。

同時(shí)選取正常生長、20 mmol/LNa2CO3處理、200 mmol/L NaCl處理下的各組材料測(cè)定表達(dá)量，在紅米KY-1、SY-1中，不同處理下表達(dá)水平相較于白米（野生型）均有明顯升高；該差異在鹽處理（圖5-I）、堿處理（圖5-H）下表現(xiàn)相似，在SY-1中，表達(dá)水平與其他材料差異顯著，KY-1的表達(dá)水平有所提升。

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，以優(yōu)質(zhì)粳稻品種上育453、空育180為研究材料，對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，通過產(chǎn)生移碼突變剔除終止子，改變氨基酸序列，從分子手段上成功恢復(fù)紅米表型，相比于傳統(tǒng)的雜交培育優(yōu)質(zhì)紅稻的方法，在技術(shù)和效率上有極大的提高，很大程度上縮短育種年限，成功獲得優(yōu)質(zhì)紅稻。

在馴化水稻過程中，絕大部分水稻的基因第6外顯子區(qū)域存在14 bp的堿基缺失，導(dǎo)致氨基酸序列提前終止，使得紅米表型喪失，研究發(fā)現(xiàn)，在的終止子前增減正確的堿基數(shù)目后，bHLH結(jié)構(gòu)域能夠正常表達(dá)，較產(chǎn)物雖缺失一段短肽，仍可恢復(fù)紅米表型。紅稻對(duì)非生物脅迫具有一定的耐受能力，雜草紅稻能夠在稻田中頑固生長，因而期望種皮性狀恢復(fù)后，能夠恢復(fù)部分非生物脅迫耐受能力。

A～D分別為0、30、100、200 mmol/L NaCl溶液處理下各組的芽長；E～F分別為20和10mmol/L Na2CO3下各組的芽長；G―200 mmol/L NaCl處理的芽長（標(biāo)尺=2 cm）；H―20 mmol/L Na2CO3處理的幼苗生長情況（標(biāo)尺=2 cm）。

Fig. 4. Identification of salt and alkali tolerance of T2generation transgenic plants.

A～C―200 mmol/L NaCl處理下耐鹽標(biāo)記基因表達(dá)量；D～F―20 mmol/L Na2CO3處理下耐堿標(biāo)記基因表達(dá)量；G～I(xiàn)―200 mmol/L NaCl、20 mmol/L Na2CO3及空白對(duì)照Rc表達(dá)量。ns表示無顯著差異、**、***、****表示分別在0.005、0.001、0.0001水平上顯著差異（t檢驗(yàn)）。KY180―空育180；SY453―上育453；KY-1―空育180的基因編輯株系；SY-1―上育453的基因編輯株系。

Fig. 5. Identification of saline-alkali tolerance related gene expression levels in T2transgenic plants.

根據(jù)前人研究[26-31]，參與多條代謝通路調(diào)節(jié)根系細(xì)胞生長和能量轉(zhuǎn)化，能提高非生物應(yīng)激能力；參與調(diào)控鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)，參與調(diào)控鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)，在鹽應(yīng)激反應(yīng)中，具有調(diào)節(jié)滲透壓提高鹽脅迫耐受能力的作用，鹽處理?xiàng)l件下，、、均上調(diào)表達(dá)，將其選作標(biāo)記基因研究耐鹽能力；、、均為鐵離子調(diào)節(jié)因子，能夠維持植物體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)，耐受土壤pH變化保障植物正常生長，在堿處理?xiàng)l件下，均上調(diào)表達(dá)，將其選作標(biāo)記基因研究耐堿能力。在對(duì)T2代植株耐鹽堿試驗(yàn)中，SY-1表現(xiàn)出良好的耐鹽堿能力，且標(biāo)記基因表達(dá)水平有明顯差異，但KY-1的耐鹽標(biāo)記基因表達(dá)水平并未表現(xiàn)出明顯提高，而在耐堿試驗(yàn)中觀察到有差異的表型，且耐堿標(biāo)記基因表達(dá)水平上存在一定差異，證明恢復(fù)紅種皮性狀能夠提高部分耐鹽堿能力，導(dǎo)致KY-1與SY-1在耐鹽能力上表現(xiàn)出的不同趨勢(shì)的原因尚不清楚，推測(cè)可能與不同材料背景下的遺傳差異有關(guān)，也可能與標(biāo)記基因的選擇有關(guān)，可進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

在本研究中，雖獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株13株，但剝皮發(fā)現(xiàn)一部分植株的種子并未表現(xiàn)出紅米表型，即雖轉(zhuǎn)化成功，但未產(chǎn)生有效的突變。在14 bp堿基缺失的基礎(chǔ)上，增減正確數(shù)目的堿基后，方可繼續(xù)表達(dá)缺失的bHLH結(jié)構(gòu)域；當(dāng)插入過多或過少堿基時(shí)后續(xù)序列仍為無效的堿基序列，并不能正常表達(dá)bHLH結(jié)構(gòu)域，紅米表型無法有效恢復(fù)，而鑒定得到的兩種編輯植株株系，均為純合株系，性狀遺傳穩(wěn)定，且基因表達(dá)水平相較于野生型（白米）有顯著差異。雖期望恢復(fù)紅米性狀的編輯材料能夠表現(xiàn)較強(qiáng)的耐脅迫能力，但耐鹽堿的表型數(shù)據(jù)低于預(yù)期，而與本研究耐鹽堿標(biāo)記基因的聯(lián)系尚不明朗，且基因表達(dá)量在正常生長、耐鹽堿處理情況下均表現(xiàn)極顯著差異，可在后續(xù)研究進(jìn)一步探究編輯材料耐鹽堿表型差異與基因在非生物脅迫中的作用。

目前，CRISPR/Cas9技術(shù)在植物研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，尤其是在水稻的種質(zhì)改良中。紅米作為一種優(yōu)質(zhì)的特性，尚且存在很大的研究空間，雖在本研究中成功獲得紅米性狀恢復(fù)株系，且效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)育種，依舊存在部分潮霉素篩選鑒定成功而恢復(fù)表型失敗的株系，證明技術(shù)手段仍存在一定的不足；且尚未在大田擴(kuò)大規(guī)模種植，可在后續(xù)研究中進(jìn)一步探究其他農(nóng)藝性狀是否存在差異。更優(yōu)質(zhì)的水稻種質(zhì)培育，仍是科研工作者的遠(yuǎn)大目標(biāo)，本研究可為優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)紅米性狀提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

[1] 牛怡君. 基于大數(shù)據(jù)背景下健康管理的食品營養(yǎng)運(yùn)用研究[J]. 現(xiàn)代食品, 2020(14): 129-131.

Niu Y J. Research on the application of food nutrition in health management based on big data[J]., 2020(14): 129-131. (in Chinese)

[2] 胡時(shí)開, 胡培松. 功能稻米研究現(xiàn)狀與展望[J]. 中國水稻科學(xué), 2021, 35(4): 311-325.

Hu S K, Hu P S. Research status and prospect of functional rice[J]., 2021, 35(4): 311-325. (in Chinese with English abstract)

[3] 李玉純, 畢寶山, 鄭美花. 特種稻米及開發(fā)前景[J]. 吉林農(nóng)業(yè), 2001(10): 10-11.

Li Y C, Bi B S, Zheng M H. Special rice and its development prospects[J]., 2001(10): 10-11. (in Chinese)

[4] 王子平. 中國紅米資源的研究與利用進(jìn)展[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(4): 32-34.

Wang Z P. Research and utilization of red rice resources in China[J]., 2008, 36(4): 32-34. (in Chinese)

[5] Finocchiaro F, Ferrari B, Gianinetti A, Dall'Asta C, Pellegrini N. Characterization of antioxidant compounds of red and white rice and changes in total antioxidant capacity during processing[J]., 2010, 51(8): 1006-1019.

[6] 吳建, 余顯權(quán). 水稻紅米色素基因的初步定位[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào), 2017, 36(3): 75-77.

Wu J, Yu X Q. Preliminary mapping of pigment genes in rice red rice[J]., 2017, 36(3): 75-77. (in Chinese with English abstract)

[7] Furukawa T, Maekawa M, Oki T, Suda I, Iida S, Shimada H, Takamure I, Kadowaki K. Theandgenes are involved in proanthocyanidin synthesis in rice pericarp[J]., 2007, 49(1): 91-102.

[8] Sweeney Megan T, Michael J T, Bernard E P, Susan M C. Caught Red-Handed:encodes a basic helix-loop-helix protein conditioning red pericarp in rice[J]., 2006, 18(2): 283-294.

[9] Sweeney M T, Thomson M J, Cho Y G, Park Y J, Williamson S H, Bustamante C D. Global dissemination of a single mutation conferring white pericarp in rice[J]., 2007, 3(8): e133.

[10] Wang W J, Zhao M H, Zhang G C, Liu Z M, Hua Y C, Jia X T, Song J Y, Ma D R, Sun J. Weedy rice as a novel gene resource: A genome-wide association study of anthocyanin biosynthesis and an evaluation of nutritional quality[J]., 2020, 11: 878.

[11] Juan C L, Sun L D, Ping S Z, Soo S H, Lu B R. Gene flow from cultivated rice () to its weedy and wild relatives[J]., 2004(1): 67.

[12] Lang H, He Y T, Zeng F L, Xu F, Zhao M, Ma D. Comparative transcriptomic and physiological analyses of weedy rice and cultivated rice to identify vital differentially expressed genes and pathways regulating the ABA response[J]., 2021, 11(1): 12881.

[13] Wang M, Mao Y, Lu Y, Wang Z, Tao X, Zhu, J K. Multiplex gene editing in rice with simplified CRISPR- Cpf1 and CRISPR-Cas9 systems[J]., 2018, 60(8): 626-631.

[14] Li X F, Zhou W J, Ren Y K, Tian X J, Lü T X, Wang Z Y, Fang J, Chu C C, Yang J, Bu Q Y. High-efficiency breeding of early-maturing rice cultivars via CRISPR/ Cas9-mediated genome editing[J]., 2017, 44: 175-178.

[15] Zhang Q, Zhang Y, Lu M H, Chai Y P, Jiang Y Y, Zhou Y, Wang X C, Chen Q J. A novel ternary vector system united with morphogenic genes enhances CRISPR/Cas delivery in maize[J]., 2019, 181(4): 1441-1448.

[16] Al Amin N, Ahmad N, Wu N, Pu X M, Ma T, Du Y Y, Bo X X, Wang N, Sharif R, Wang P W. CRISPR-Cas9 mediated targeted disruption ofmicrosomal omega-6 desaturase in soybean (. L)[J]., 2019, 19(1): 9.

[17] 徐善斌, 鄭洪亮, 劉利峰, 卜慶云, 李秀峰, 鄒德堂. 利用CRISPR/Cas9技術(shù)高效創(chuàng)制長粒香型水稻[J]. 中國水稻科學(xué), 2020, 34(5): 406-412.

Xu S B, Zhen H L, Liu L F, Bu Q Y, Li X F, Zou D T. Using CRISPR/Cas9 technology to efficiently create long grain fragrant rice[J]., 2020, 34(5): 406-412.(in Chinese with English abstract)

[18] 周文甲, 田曉杰, 任月坤, 魏祥進(jìn), 高揚(yáng), 謝黎虹, 劉華招, 卜慶云, 李秀峰. 利用CRISPR/Cas9創(chuàng)造早熟香味水稻[J]. 土壤與作物, 2017, 6(2): 146-152.

Zhou W J, Tian X J, Ren Y K, Wei X J, Gao Y, Xie L H, Liu H Z, Bu Q Y, Li X F. CRISPR/Cas9 technology was used to create early-maturing fragrant rice[J]., 2017, 6(2): 146-152.(in Chinese with English abstract)

[19] Xu Y, Lin Q P, Li X F, Wang F Q, Chen Z H, Wang J, Li W Q, Fang J, Tao Y J, Jiang Y J, Wei X D, Zhang R, Zhu Q H, Bu Q Y, Yang J, Gao C X. Fin-tuning the amylose content of rice by precise base editing of thegene[J]., 2021, 19(1): 11-13.

[20] 蘇正亮. 特種稻紅米品種紅稻8號(hào)選育及栽培技術(shù)[J]. 鄉(xiāng)村科技, 2020(21): 2.

Su Z L. Breeding and cultivation techniques of special rice red rice variety Hongdao 8[J]., 2020(21): 2. (in Chinese)

[21] 宗偉勛, 林建勇, 溫灶嬋, 梁克勤, 梁結(jié)彩, 榮建星, 鄧漢儒. 特優(yōu)質(zhì)紅米雜交水稻新組合清紅優(yōu)1號(hào)[J]. 雜交水稻, 2022, 37(2): 53-55.

Zong W X, Lin J Y, Wen Z C, Liang K Q, Liang C J, Ron J X, Deng H R. High quality hybrid red rice Qinghongyou 1[J]., 2022, 37(2): 53-55. (in Chinese with English abstract)

[22] 李文紹, 許鴻江, 廖榮周. 紅米稻開發(fā)前景及其遺傳育種研究進(jìn)展[J]. 福建農(nóng)業(yè)科技, 2013(4): 4

Li W Z, Xu H J, Liao R Z, Development prospect and genetic breeding of red rice[J]., 2013(4): 4. (in Chinese)

[23] Zhu Y W, Lin Y R, Chen S B, Liu H Q, Chen Z J, Fan M Y, Hu T J, Mei F T, Chen J M, Chen L, Wang F. CRISPR/Cas9 edited functional recovery of the recessiveallele to develop red rice[J]., 2019, 17(11): 2096-2105.

[24] 曾棟昌, 馬興亮, 謝先榮, 祝欽瀧, 劉耀光. 植物CRISPR/Cas9多基因編輯載體構(gòu)建和突變分析的操作方法[J]. 中國科學(xué): 生命科學(xué), 2018, 48(7): 783-794.

Zeng D C, Ma X L, Xie X R, Zhu Q L, Liu Y G. Operational methods for plant CRISPR/Cas9 multi-gene editing vector construction and mutation analysis[J]., 2018, 48(7): 783-794. (in Chinese with English abstract)

[25] Ma X L, Zhang Q Y, Zhu Q L, Liu W, Chen Y, Qiu R, Wang B, Yang Z F, Li H Y, Lin Y R, Xie Y Y, Shen R X, Chen S F, Wang Z, Chen Y L, Guo J X, Chen L T, Zhao X C, Dong Z C, Liu Y G. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J]., 2015, 8(8): 1274-1284.

[26] Hartmann L, Pedrotti L, Weiste C, Fekete A, Schierstaedt J, Gittler J, Kempa S, Krischke M, Dietrich K, Mueller M J, Vicente-Carbajosa J, Hanson J, Droge-Laser W. Crosstalk between two bZIP signaling pathways orchestrates salt-induced metabolic reprogramming inroots[J]., 2015, 27: 2244-2260.

[27] Fukuda A, Nakamura A, Hara N, Toki S, Tanaka Y. Molecular and functional analyses of rice NHX-type Na+/H+antiporter genes[J]., 2011, 233(1): 175-188.

[28] Passricha N, Saifi S K, Kharb P, Tuteja N. Rice lectin receptor-like kinase provides salinity tolerance by ion homeostasis[J]., 2020, 117(2): 498-510.

[29] Ogo Y, Itai R N, Nakanishi H, Kobayashi T, Takahashi M, Mori S, Nishizawa N K. The rice bHLH protein OsIRO2 is an essential regulator of the genes involved in Fe uptake under Fe-deficient conditions[J]., 2010, 51(3): 366-377.

[30] Kobayashi T, Ogo Y, Itai R N, Nakanishi H, Takahashi M, Mori S, Nishizawa N K. The transcription factor IDEF1 regulates the response to and tolerance of iron deficiency in plants[J]., 2007, 104(48): 19150-19155.

[31] Tan S, Yin L P. Research of the iron-regulated transporter 1 (IRT1) in the past decades and its latest development[J]., 2017, 62(5): 350-359.

Breeding ofFunction Restoration Red Rice via CRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing

ZHANG Yuanye1, YIN Liying1, LI Rongtian1,*, HE Mingliang2, LIU Xinxin3, PAN Tingting4, TIAN Xiaojie2, BU Qingyun2, LI Xiufeng2,*

(1College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China;2Northeast Institute of Geography and Agroecology, Key Laboratory of Soybean Molecular Design Breeding, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China;3College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;4College of Agriculture, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China;*Corresponding author, email: lirongtian07@aliyun.com; lixiufeng@iga.ac.cn)

【Objective】It is of great value to restore cultivated rice varieties to red rice with good rice quality and strong stress resistance. CRISPR/Cas9 gene editing technology was used to edit thegene, restoring the red seed coat, and laying a data foundation for the improvement of rice quality and resistance.【Methods】Using CRISPR/Cas9 technology, the target genemutant vector pYLCRISPR/ Cas9--gRNA was constructed and transformed into transgenic plants with Kongyu 180 and Shangyu 453 as materials. The results were verified by sequencing and phenotypic observation. 【Results】 Twomutants were obtained. For KY-1, with 4 bases deleted from 1414bp to1417 bp, the terminator was replaced by phenylalanine. SY-1 also lost a base at 1411 bp, which resulted in the transformation from the terminator to aspartic acid. The two kinds of editing materials restored red rice phenotype and had certain saline-alkali tolerance.【Conclusion】Using CRISPR/Cas9 technique, we obtained homozygous lines with red seed coat, providing basic materials for the improvement of red rice.

rice;; red episperm; salinity tolerance; CRISPR/Cas9

10.16819/j.1001-7216.2022.211205

2021-12-07；

2022-03-10。

黑龍江省杰出青年基金資助項(xiàng)目(JQ2020C003); 中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(A類)(XDA28100000)。