硫藤黃鏈霉菌St-79對水稻白葉枯病的防效和促生作用

馬靜靜?潘妍妍?楊孫玉悅?王嘉琦?蔣冬花

硫藤黃鏈霉菌St-79對水稻白葉枯病的防效和促生作用

馬靜靜?潘妍妍?楊孫玉悅?王嘉琦?蔣冬花*

(浙江師范大學 化學與生命科學學院, 浙江 金華 321004;*通信聯系人, email: jdh@zjun.cn)

【目的】水稻白葉枯病是水稻的主要細菌性病害之一，嚴重影響水稻生產。本研究獲得一株有效防治水稻白葉枯病的放線菌菌株，探索其對白葉枯病的防效和促進水稻生長的作用，為生防菌的開發利用提供科學依據。【方法】利用梯度稀釋涂布法、共培養法和牛津杯法篩選拮抗水稻白葉枯病菌(pv.,)的放線菌菌株；通過形態特征、生理生化反應、16S rDNA序列和系統發育樹分析對其進行分類鑒定；利用共培養法分析目標菌株的抗菌譜；通過96孔板微量稀釋法、掃描電子顯微鏡、微生物粘附碳氫化合物法等探究目標菌株的抑菌作用；通過發酵濾液浸種與菌液噴灑土壤的方法探究其對水稻生長的促進作用；利用盆栽試驗探索目標菌株發酵濾液對水稻白葉枯病的防治效果。【結果】從不同生境土壤中分離出140株放線菌菌株，最終篩選得到一株對具有強拮抗活性的放線菌菌株St-79，其發酵濾液抑菌圈直徑為64 mm，并鑒定其為硫藤黃鏈霉菌()。菌株St-79對水稻細菌性條斑病菌(pv.)、大豆細菌性斑疹病菌(pv.)、油菜黑腐病菌(pv.)和番茄細菌性葉斑病菌(pv.)均有拮抗作用。其乙酸乙酯粗提物具有良好的抑制生長的效果，粗提物對的最低抑菌濃度為8 μg/mL，最低殺滅濃度為32 μg/mL；掃描電鏡觀察結果顯示，粗提物對細胞有很強的損傷作用；粗提物還能改變細胞內膜通透性，降低細胞的疏水性。促生試驗結果顯示，菌株St-79發酵濾液能夠促進水稻幼苗的生長。盆栽試驗結果顯示，菌株St-79發酵濾液對水稻白葉枯病有良好的防治效果，在日本晴、甬優15、甬優1540上的相對防效為65.95%～87.23%，病斑抑制率為69.85%～95.8%，且預防效果優于治療效果。【結論】獲得一株有效防治水稻白葉枯病的放線菌，其對水稻白葉枯病菌有明顯的抑制作用，并且可以促進水稻種子的萌發與幼苗的生長。

放線菌；硫藤黃鏈霉菌；水稻白葉枯病菌；發酵濾液；生物防治；促生作用

水稻白葉枯病是由水稻黃單胞桿菌(pv.以下均縮寫為)引起的。現階段，我國遭遇白葉枯病侵害的地區主要集中于華東、華中等水稻生產區[1]。該病菌經由水流傳播，通過葉片上的水孔或傷口侵入水稻，一旦發生水稻白葉枯病，一般減產10%左右，嚴重的減產50%～ 60%，甚至90%[2, 3]。水稻白葉枯病的防治方法有化學防治和生物防治等。目前，水稻白葉枯病的防治多以化學防治為主，這是由于該方法見效快、成本低，使用的藥劑主要有噻唑鋅、噻枯唑、噻森銅[4]，但化學防治存在易殘留、污染環境等問題。生物防治則對環境更友好，具有廣闊的應用前景[5]。放線菌能夠產生許多次生代謝產物，如疏螺體素(Borrelidin)可用于大豆疫霉菌防治[6]，茴香霉素(Anisomycin)可用于真菌病害防治[7]。鏈霉菌作為放線菌門的一個重要分支，在植物病害的防治上已有諸多報道：鏈霉菌LA-5可用于防治番茄灰霉病[8]；黃麻鏈霉菌() AUH-1[9]對西瓜枯萎病菌、煙草黑脛病菌、水稻紋枯病菌等具有拮抗活性；丁香鏈霉菌()Sl-3對大豆斑疹病菌有很好的防治作用(相對防效93.17%)等[10]。鏈霉菌拮抗水稻白葉枯病也有一些報道，如：鏈霉菌[11]產生的波卓霉素A2和杜奈霉素D3S對有拮抗作用；鏈霉菌12的發酵液對有較強的拮抗作用[12]；鏈霉菌Sr-63[13]對水稻白葉枯病有良好的防治效果等。鏈霉菌也被認為是潛在的植物促生菌[14-16]，它們會產生植物激素(IAA)、鐵載體等促進植物生長[17-19]。目前，國內外針對拮抗水稻白葉枯病菌放線菌菌株的篩選，防效及其對水稻植株促生作用的研究較少。本研究從不同生境土壤中篩選獲得顯著拮抗的放線菌菌株，研究其對水稻白葉枯病的防治效果及促生作用，以期為水稻白葉枯病的生物防治提供菌種資源。

1?材料與方法

1.1?菌種

供試土壤采自浙江省金華市尖峰山、雙龍洞、蘭溪、北山等地植被茂密處地下5－10 cm，分離、純化后獲得供試放線菌菌株。水稻白葉枯病菌(pv.,)的P6小種PXO86菌株，?80℃下保存于浙江師范大學微生物資源開發利用實驗室。

4種植物病原細菌：水稻條斑病菌(pv., RS105)、大豆斑疹病菌(pv., NEAU001)、油菜黑腐病菌(.pv., ZJNb5)、番茄葉斑病菌(.pv., DC3000)由本實驗室提供，保存于?80℃冰箱中。

1.2?放線菌菌株的分離與純化

取1 g干燥土樣置于99 mL無菌水中，培養30 min(120 r/min、28℃)，梯度稀釋上清液，取合適濃度的土壤稀釋液100 μL均勻涂抹于含有50 μg/mL K2Cr2O7的高氏1號培養基[20]平板上，28℃下恒溫培養7 d。出現菌落后，挑取具有典型放線菌特征的單菌落轉接于另一高氏1號培養基平板上，純化3次，得到純菌株[21]。將菌株編號，用25%甘油保存于?80℃冰箱中備用。

1.3?拮抗白葉枯病菌的放線菌菌株的篩選

1.3.1?共培養法初篩

取直徑5 mm的放線菌菌餅，倒置接種于含的高氏1號固體培養基上，28℃下培養3 d，測定抑菌圈大小，初步篩選出具有拮抗作用的放線菌菌株[10]。

1.3.2?牛津杯法復篩

將初篩獲得的放線菌菌株接種于高氏1號液體培養基中，培養7 d(160 r/min、28℃)，離心(10 000 r/min、5 min)、過濾，收集發酵濾液。將接種于NA液體培養基[22]中，培養(160 r/min、28℃)至600=0.6。將100 μL菌液均勻涂布于NA固體培養基平板上，取150 μL放線菌菌株發酵濾液，采用牛津杯法[23]測定各菌株對的抑制作用。根據抑菌圈大小篩選拮抗作用最強的放線菌菌株。每個處理重復3次，以高氏1號液體培養基為空白對照，28℃下靜置培養。

1.4?拮抗Xoo目標菌株的鑒定

1.4.1?目標菌株形態特征觀察

將目標菌株接種至高氏1號培養基平板上培養8 d，記錄目標菌株菌落的特征，如顏色、大小、形態等[24]。將蓋玻片斜插入高氏1號培養基平板后劃線接種目標菌株，在培養箱中培養7 d后，將蓋玻片置于光學顯微鏡下，觀察目標菌株菌落的菌絲、孢子絲等形態特征[25]。

1.4.2?目標菌株的生理生化特征實驗

對目標菌株進行淀粉水解、明膠液化、碳源氮源利用等[26-28]實驗。

1.4.3?目標菌株的16S rDNA序列分析

將目標菌株送至上海生工生物工程有限公司測序，利用通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和1492R(5＇-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3＇)進行PCR擴增并測序，將得到的16S rDNA序列提交至GenBank并利用BLAST比對分析，采用MEGA 5軟件的鄰接法構建系統發育樹，確定目標菌株的種屬地位[21]。

1.5?目標菌株抗菌譜的測定

將1.1中4種植物病原細菌活化后接種于NA液體培養基中，培養(160 r/min、28℃)至600=0.6。以高氏1號空白培養基為對照，共培養法測定目標菌株對不同病原細菌的抑菌圈直徑，每組設置3次平行實驗。

1.6?目標菌株抑菌作用的探究

1.6.1?粗提物制備

用乙酸乙酯反復攪拌萃取目標菌株發酵液，直至有機相層基本無色。將乙酸乙酯萃取液合并，用旋轉蒸發儀減壓蒸發，得到目標菌株乙酸乙酯粗提物(以下簡稱為粗提物)。

1.6.2?粗提物對的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定

用甲醇溶解一定質量的粗提物，配制成濃度為1280 μg/mL的溶液，保存在?20℃冰箱中備用。

用96孔板微量稀釋法[29]測定粗提物對的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。設置空白培養基對照與陽性對照，其余9孔粗提物濃度分別為2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL，每個處理重復3次。培養24 h后，從各培養液中分別吸取100 μL菌液，均勻涂布于NA平板上，若培養液澄清但48 h后NA平板上有菌生長，則判定該濃度為MIC；若培養液澄清且96 h后NA平板上無菌生長，則判定該濃度為MBC[30]。

1.6.3?粗提物對生長曲線的影響

通過測定生長曲線來評估粗提物的抗菌活性。將生長到對數期的稀釋為0.5個標準麥氏度(1×108～2×108CFU/mL)并與粗提物混合，使得粗提物濃度分別為2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL，以不加粗提物的NA液體培養基為空白對照。將接種好的放到搖床培養48 h(28℃，160 r/min)，期間每2 h測一次600值。將所得數據進行整理，繪制生長曲線。每個濃度進行3次重復實驗。

1.6.4?粗提物對細胞結構的影響

將接種到NA液體培養基中，28℃、160 r/min下培養至對數生長期，10 000 r/min下離心5 min收集菌體，用磷酸緩沖液(PBS緩沖液)沖洗3次后，將菌體重懸(加入PBS緩沖液)至0.5個標準麥氏度(1×108～2×108CFU/mL)。將菌液與粗提物溶液混合，使得不同處理中粗提物的濃度分別為4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL，以相同體積的PBS緩沖液加入為空白對照。搖床培養4 h后收集菌體(10 000 r/min，5 min)。將收集的菌體用PBS緩沖液沖洗3次，加入2.5%戊二醛于4℃冰箱中固定過夜，再用PBS緩沖液清洗。用不同濃度的乙醇對菌體進行梯度脫水，叔丁醇浸泡置換乙醇3次，使用真空冷凍干燥機干燥，樣品噴金后在掃描電子顯微鏡下進行觀察。

1.6.5?粗提物對細胞內膜通透性的影響

收集對數生長期的菌體(10000 r/min，5 min)，PBS緩沖液沖洗3次后，將菌體重懸(加入PBS緩沖液)至0.5個標準麥氏度(1～2×108CFU/mL)。將菌液與粗提物混合，使得不同處理中粗提物的濃度分別為4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL，以相同體積的PBS緩沖液加入為空白對照。每個處理中加入500 μL濃度為30 mmol/L的2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖，混合均勻，28℃、160 r/min下振蕩培養4 h，將各處理液于10 000 r/min下離心5 min收集菌體，取上清液測定420 nm處的吸光度，觀察生成的鄰硝基苯酸(ONP)的變化情況[30]。每個濃度重復3次。

1.6.6?粗提物對白葉枯病菌()細胞疏水性的測定

采用微生物粘附碳氫化合物法(microbial adhesion to hydrophobicity，MATH)[31]測定粗提物對表面疏水性的影響。收集對數生長期的菌體(10 000 r/min，5 min)，PBS緩沖液沖洗3次后，將菌體重懸(加入PBS緩沖液)至0.5個標準麥氏度(1×108～2×108CFU/mL)。將菌液與粗提物混合，使得不同處理中粗提物的濃度分別為4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL，以相同體積的PBS緩沖液加入為空白對照。作用4 h后，10 000 r/min下離心5 min后去上清，將菌體用PBS緩沖液重懸并調至600=0.6(0)。以4∶1的比例混合菌懸液與正己烷，劇烈振蕩120 s，室溫靜置使得兩相分離，取下層水相測定其在600 nm 處的紫外吸收值(1)。重復3次。

細菌細胞表面疏水率(CSH)按下式計算：

CSH(%)=(對照組OD600?處理組OD600)對照組OD600×100。

1.7?目標菌株發酵濾液對水稻生長的影響

挑選飽滿的日本晴水稻種子，28℃下用無菌水浸種催芽24 h。按照1.3.2中的方法制備目標菌株的發酵濾液。

1.7.1?對水稻種子萌發的影響

用發酵濾液原液及其10倍、50倍、100倍、500倍稀釋液分別對催芽后的水稻種子進行浸種處理；用無菌水將高氏1號液體培養基按上述倍數稀釋后作為對照；以無菌水處理作為兩者的共同對照，每個處理3次重復，每次重復50粒種子。將種子放入培養皿中，培養皿中分別加入各處理液20 mL，每隔2 d更換1次對應的處理液，自種子浸種之日起每天觀察種子發芽情況，以種子露白作為發芽標準[18]。

1.7.2?土培條件下對水稻種子萌發和幼苗生長的影響

取200 mL無菌水稀釋100倍、500倍目標菌株發酵濾液噴灑在土壤表面，然后將50粒種子均勻撒播在土壤上，覆土，后置于培養箱中培養。以無菌水對高氏1號液體培養基作上述處理為對照；以無菌水作為兩者的共同對照。培養條件如下：光照16 h(30oC)/黑暗8 h(25oC)，相對濕度65%，每兩天噴灑一次對應的溶液。記錄種子萌發及幼苗生長的情況，播種21 d后取樣，記錄幼苗的高度及鮮質量、干質量等情況并計算生長促進率[18]。

生長促進率(%)=[(處理生長指標?對照生長指標)/對照生長指標]×100。

1.8?目標菌株發酵濾液對水稻白葉枯病的防效

1.8.1?水稻的培育

選取對易感的日本晴、甬優15、甬優1540水稻種子水培至種子發芽后播種到土壤中，置于培養箱培養至水稻葉片長度超過20 cm，備用。培養條件：光照16 h(30oC)/黑暗8 h(25oC)，濕度65%，每兩天澆一次水，每一周噴一次營養液。

1.8.2?防效實驗

按照1.3.2的方法制備菌液及目標菌株發酵濾液，將發酵濾液用無菌水稀釋4倍、5倍、6倍備用。具體處理方法如表1所示。

以上各組處理均需對剪葉部位做好保濕工作，每個處理6株，每株5片葉(同位葉)，每個處理重復3次。待病情發展趨于穩定后，記錄并統計發病情況。

以葉片為單位調查病情，水稻白葉枯病病情分0～9級[32]，標準如下：0級，剪口處無病斑；1級，病斑面積為葉面積10%以下；3級，病斑面積為葉面積的11%～25%；5級，病斑面積為葉面積的26%～45%；7級，病斑面積為葉面積的46%～65%；9級，病斑面積為葉面積的65%以上。

病情指數(%)=∑(各級病葉數×相應級數值)/(調查總葉數×9)×100；

相對防治效果(%)=[(對照區病情指數?處理區病情指數)/對照區病情指數]×100；

病斑抑制率(%)=(對照區病斑長度?處理病斑長度)/對照區病斑長度×100。

2?結果與分析

2.1?放線菌菌株的分離與純化

通過分離純化從不同生境土壤中獲得140株放線菌純菌株，其中5株在高氏1號培養基上培養7 d的菌落如圖1所示。

2.2?拮抗Xoo放線菌菌株的獲得

使用共培養法和牛津杯法對140株放線菌菌株進行初篩和復篩，最終獲得一株拮抗作用最強的放線菌菌株，該菌分離自金錢松()根際土壤，編號為菌株St-79，對的抑菌圈直徑為64±1.2 mm (圖2)。

表1?防效試驗設計

圖1? 5株放線菌菌株的菌落形態

Fig. 1. Colonies of 5 actinomyces strains.

2.3?菌株St-79的分類學鑒定

2.3.1?形態學特征

在高氏1號培養基中28℃下培養7 d后，St-79菌落較大，呈粉紅色，表面呈絲絨狀；氣生菌絲分化形成孢子絲，孢子絲呈一級或二級輪生(圖3)。

2.3.2?生理生化結果

菌株St-79能水解淀粉、纖維素、脂肪、明膠(表2)；可利用多種碳源，利用效果較佳的是葡萄糖、甘露醇、乳糖等；可利用多種氮源，較佳氮源是蛋白胨、(NH4)2SO4、賴氨酸、組氨酸等(表3)；適宜酸堿度是7.3，最適轉速為160 r/min，適宜培養溫度是28℃。

2.3.3?16S rDNA 序列分析結果

在GenBank中經BLAST比對分析發現，菌株St-79與硫藤黃鏈霉菌()的進化距離最近，相似性達99.99%。根據菌株St-79的形態特征、生理生化反應結果和16S rDNA序列分析，結合鏈霉菌屬()分種檢索表和用MEGA 5構建系統發育樹(圖4)，發現與其親緣關系最近的為硫藤黃鏈霉菌，鑒定菌株St-79為硫藤黃鏈霉菌()。

A－高氏一號液體培養基對照；B－菌株St-79的發酵濾液處理。

Fig. 2. Inhibition zone of fermentation liquid of the strain St-79 against.

A、B－菌株St-79的菌落形態；C、D－光學顯微鏡下的氣生菌絲體和孢子絲。

Fig. 3. Colony and microscopic observation of strain St-79.

表2?菌株St-79生理生化試驗結果

“+++”表示能力強，“++”表示能力中，“+”表示能力較弱，“?”表示無。

“+++”, Strong; “++”, Medium; “+”, Weak; “?”, None

表3?菌株St-79碳源、氮源利用試驗結果

“+++”表示生長旺盛，“++”表示生長良好，“+”表示生長一般。

“+++”, Abundant growth; “++”, Moderate growth; “+”, Growth.

2.4?菌株St-79抗菌譜的測定

實驗結果表明(圖5)，菌株St-79對4種植物病原細菌均有不同程度的抑制作用，其中，對水稻細菌性條斑病菌、油菜黑腐病菌和大豆細菌性斑疹病菌的抑制作用較強，抑菌圈直徑分別34.85、33.95、32.25 mm；對番茄細菌性葉斑病菌抑制作用較弱，抑菌圈直徑為19.95 mm(表4)。

2.5?菌株St-79抑菌作用的探究

2.5.1?粗提物對最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定

如表5所示，當粗提物的濃度為8 μg/mL及更高時，培養液澄清透明，表明在該濃度下的生長受到抑制。分別從各處理中取100 μL菌液均勻涂于NA培養基，發現培養96 h后，32 μg/mL及更高濃度處理的平板均無菌生長，說明粗提物對的MIC為8 μg/mL，MBC為32 μg/mL。

圖4?基于16S rDNA序列構建的菌株St-79進化樹

Fig. 4. Phylogenetic tree of strain St-79 based on the 16S rDNA sequence.

A－水稻細菌性條斑病菌；B－油菜黑腐病菌；C－大豆細菌性斑疹病菌；D－番茄細菌性葉斑病菌。

Fig. 5. Antibacterial effect of fermentation liquid of strain St-79 against four kinds of plant pathogenic bacteria.

表4?菌株St-79對4種植物病原細菌的抑制效果

不同小寫字母表示在< 0.05水平存在顯著差異。

Different letters indicate significant differences at the< 0.05 level.

表5?菌株St-79粗提物對Xoo的MIC和MBC

圖6?不同濃度粗提物對Xoo生長的抑制作用

Fig. 6. Inhibitory effects of different concentrations of crude extracts on the growth of.

2.5.2?粗提物對生長曲線的影響

如圖6所示，不同濃度的粗提物對的生長均有不同程度的抑制作用。當粗提物濃度為32 μg/mL時，不能生長，具有明顯的致死效應，當粗提物濃度低于32 μg/mL時，隨著粗提物濃度的增大，對的抑制作用越強。

2.5.3?粗提物對細胞結構的影響

如圖7所示，空白對照中，細胞是一個完整、飽滿的桿狀，表面正常(圖7-A)；圖7-B顯示，4 μg/mL處理組的少數細胞表面出現凹陷與褶皺；圖7-C顯示，8 μg/mL處理組中，大量細胞出現嚴重的褶皺，呈不規則形狀且變形的細胞數量明顯增多，少數菌體表面出現破損；圖7-D顯示，16 μg/mL處理組中，大量細胞出現嚴重的破損與變形，細胞內含物流出；圖7-E顯示，32 μg/mL處理組中，細胞變得干癟，菌體被溶解失去形態。由此可知，粗提物會直接或者間接地導致細胞形態發生改變，且在濃度較低時就會對形態產生明顯影響，進而給正常的生長代謝產生影響，從而產生抑菌作用。

2.5.4?粗提物對細胞內膜通透性的影響

通過檢測粗提物處理后胞內β-半乳糖苷酶的滲漏情況，判斷粗提物對細胞內膜通透性的影響。如圖8所示，不同濃度的粗提物作用菌體2 h后，菌液在420 nm處的吸光度顯著高于空白對照，且隨著粗提物濃度的升高而升高。這表明粗提物對細胞內膜通透性有明顯影響，且在較低濃度與較短時間內便會改變細胞內膜通透性。

2.5.5?粗提物對細胞疏水性的測定

細胞表面疏水性與細胞表面成分有關，是細胞附著的關鍵因素。如圖9所示，經不同濃度粗提物處理4 h后，細胞疏水性均有所降低。當粗提物濃度從4、8、16 μg/mL增加到32 μg/mL時，的細胞表面疏水性分別降低10.20%、18.93%、40.33%和55.11%。由此可見，粗提物有效地降低了的疏水性。

A－對照；B－4 μg/mL；C－8 μg/mL；D－16 μg/mL；E－32 μg/mL。

Fig. 7.cells treated with crude extracts at different concentrations for 4 h under a scanning electron microscopy.

不同小寫字母表示在P < 0.05水平存在顯著差異。

Fig. 8. Intimal permeability ofcells treated with crude extracts.

2.6?菌株St-79發酵濾液對水稻生長的影響

2.6.1?對水稻種子萌發的影響

如表6、圖10所示，發酵濾液原液和培養基原液處理組都沒有種子萌發。在所有稀釋倍數中，發酵濾液100倍稀釋液處理的種子萌發率最高，顯著高于高氏1號液體培養基100倍稀釋液處理(<0.05，下同)；無菌水稀釋的發酵濾液處理組種子萌發率比同樣稀釋倍數的高氏1號液體培養基處理組高；在處理中期和后期(6 d和8 d)，發酵濾液50倍稀釋液處理與無菌水處理的種子萌發率無顯著差別；所有稀釋倍數中，只有發酵濾液100倍稀釋液處理的萌發率始終高于無菌水處理。

不同小寫字母表示在P < 0.05水平存在顯著差異。

Fig. 9. Hydrophobicity assay oftreated with different concentrations of crude extracts for 4 h.

2.6.2?菌株St-79發酵濾液噴灑土壤對水稻種子的萌發和幼苗生長的影響

2.6.2.1?對水稻種子萌發的影響

從圖11可以看出，播種7 d后，發酵濾液100倍和500倍稀釋液處理的種子萌發率最高，且兩者間有顯著差異；播種14 d后，發酵濾液500倍稀釋液處理的種子萌發率顯著高于高氏1號液體培養基500倍稀釋液處理；播種21 d后，發酵濾液100倍稀釋液處理的種子萌發率最高且顯著高于其他處理，稀釋500倍的高氏1號液體培養基處理的種子萌發率最低，稀釋500倍發酵濾液處理與無菌水處理的種子萌發率無顯著差異。

表6?發酵濾液對水稻種子萌發率的影響

不同小寫字母表示在< 0.05水平存在顯著差異。

Different letters indicate significant differences at the< 0.05 level.

不同小寫字母表示在P < 0.05水平存在顯著差異。

Fig. 10. Germination of rice seeds soaked in fermentation liquid for 8 days.

FL100、FL500分別表示菌株St-79發酵濾液稀釋100倍和500倍；KN100、KN500分別表示高氏1號液體培養基稀釋100倍和500倍，下同。不同小寫字母表示在P < 0.05水平存在顯著差異。

Fig. 11. Effect of fermentation liquid of strain St-79 on rice seed germination percentage in soil.

2.6.2.2?對水稻幼苗生長的影響

播種21 d時，選擇10株長勢一致的水稻幼苗測量株高、根長及干質量等。

從圖12和圖13-A中可以看出，不同處理組對株高影響差異明顯，發酵濾液稀釋100倍和500倍處理組的株高顯著增高，與高氏1號液體培養基稀釋100倍和500倍處理組相比分別增加約32.67%和16.19%，高氏1號液體培養基稀釋100倍處理組與無菌水處理組之間無顯著差異；發酵濾液稀釋100倍和500倍處理組的根長顯著增長，與高氏1號液體培養基稀釋100倍和500倍處理組相比約增長51.19%和31.35%(圖13-B)；發酵濾液處理對莖粗有顯著影響，與同等稀釋倍數的高氏1號液體培養基處理相比分別增加約51.96%和23.89%，高氏1號液體培養基稀釋100倍處理組與無菌水處理組相比莖粗約增加2.18%，高氏1號液體培養基稀釋500倍處理組與無菌水處理組之間無顯著差異(圖13-C)。

對水稻幼苗質量的影響：從圖14-A中可以看出，發酵濾液稀釋100倍和500倍對水稻幼苗總鮮質量、地上部鮮質量、根鮮質量有顯著的影響，對比同稀釋倍數的高氏1號液體培養基處理組，總鮮質量分別增加約62.90%、27.78%，地上部鮮質量分別增加約90.55%、39.62%，根鮮質量分別增加約27.96%、14.13%。高氏1號液體培養基稀釋100倍處理組與無菌水處理組的總鮮質量與根鮮質量無顯著差異。發酵濾液稀釋500倍處理組與無菌水處理組的根鮮質量無顯著差異。從圖14-B可以看出，發酵濾液稀釋100倍和500倍對水稻幼苗總干質量、地上部干質量、根干質量有顯著的影響，對比高氏1號液體培養基稀釋100倍和500倍處理組，總干質量分別增加約24.14%、54.82%，地上部干質量分別增加約35.57%、73.30%，根干質量分別增加約7.22%、34.62%。高氏1號液體培養基稀釋100倍處理組與無菌水處理組相比，幼苗總干質量、地上部干質量、根干質量分別顯著的增加了43.73%、69.32%、31.08%。綜上可知，發酵濾液對水稻幼苗各項生長指標都有良好的促進作用，推測菌株St-79代謝產物中含有促進水稻生長的成分。

圖12?播種21 d后發酵濾液處理組與對照組盆栽長勢比較

Fig. 12. Growth comparison of rice seedlings in fermentation liquid and control pots 21 days after sowing.

A－株高；B－根長；C－莖粗。不同小寫字母表示在P < 0.05水平存在顯著差異。

Fig. 13. Effects of fermentation liquid of strain St-79 on plant height, root length and stem diameter of rice seedlings.

A－菌株St-79發酵濾液對水稻幼苗總鮮質量、地上部鮮質量和根鮮質量的影響；B－菌株St-79發酵濾液對水稻幼苗總干質量、地上部干質量、根干質量的影響。不同小寫字母表示在P < 0.05水平存在顯著差異。

Fig. 14. Effects of fermentation liquid of strain St-79 on wet weight and dry weight of rice seedlings.

A－甬優1540；B－甬優15；C－日本晴。CK1－空白對照；CK2－只接種Xoo；T1－接種Xoo 6 h后，噴灑稀釋4倍的發酵濾液；T2－接種Xoo 6 h后，噴撒稀釋5倍的發酵濾液；T3－接種Xoo 6 h后，噴撒稀釋6倍的發酵濾液；T4－剪葉后噴灑稀釋4倍的發酵濾液，6 h后接種Xoo。下同。

Fig. 15. Lesion length of rice varieties under different treatments.

同一品種標相同小寫字母者表示在P< 0.05水平存在顯著差異。

Fig. 16. Lesion inhibition rate of rice varieties with different treatments

2.7?St-79 菌株發酵濾液對水稻白葉枯病的防效

結果如圖15～16所示，先噴灑稀釋4倍發酵濾液處理組(T4)對水稻白葉枯病具有較好的防治效果，對3個品種水稻的病斑抑制率均達到了91%以上，先接種再噴施發酵濾液處理組T1～T3對水稻白葉枯病具有一定的抑制作用，接種后，發酵濾液濃度越高，對水稻白葉枯病的防治效果越好。實驗結果還表明先噴施發酵濾液防治效果優于先接種再噴灑發酵濾液，即對水稻白葉枯病的預防效果優于治療效果。

所有處理組的病情指數如表7所示，所有品種CK2處理組的病情指數均高于90；所有品種中，先感染后治療的3個處理組T1、T2、T3的病情指數分別為16.93～22.02、23.13～27.40、27.98～32.76，先預防后感染的處理組T4中，病情指數較低，僅為12.23～15.00。

通過對3個品種水稻病情指數的計算，得到菌株St-79發酵濾液對水稻白葉枯病的相對防效(表7)。先感染后治療的處理組(T1、T2、T3)中，菌株St-79發酵濾液的濃度越高，對水稻白葉枯病的防效越好。如稀釋4倍的發酵濾液處理組T1對3個品種水稻的相對防效可達77.05%～82.31%，均高于77%；稀釋5倍的發酵濾液處理組T2對3個品種水稻的相對防效則降至71.23%～76.20%；稀釋6倍的發酵濾液處理組T3對3個品種水稻的相對防效僅為65.85%～71.28%。先預防后感染的處理組T4對3個品種水稻的相對防效高達84.38%～ 87.23%。

綜上所述，在先感染后治療的處理組(T1、T2、T3)中，病情指數隨發酵濾液濃度的降低而增大，相對防效則隨發酵濾液濃度的降低而降低；先預防后感染的處理組T4的病情指數最低，相對防效最高。

3?討論

放線菌產生的生物活性次級代謝產物，具有抗炎、抗瘧疾、抗菌等活性，大約2/3的可用抗生素是從放線菌中分離得到的[33]，鏈霉菌是放線菌門的一個重要分支，其產生的抗生素通常被用作殺菌劑。奇異鏈霉菌()能產生多種抗生素，包括大觀霉素[34]、鏈霉素等；從灰色鏈霉菌()中分離得到的Blasticidin-S是日本商業化引進的防治稻瘟病的抗生素[35]；從玫瑰輪絲鏈霉菌()中分離得到的Carbazomycin B對有著明顯的抑制作用[36]；從產色鏈霉菌()中分離得到的Oligomycin A對番茄灰霉病菌、黃瓜炭疽病菌、番茄炭疽病菌等植物病原真菌具有良好的抑菌活性[37-38]。鏈霉菌也能產生多種物質促進植物生長，被認為是一種有益的根際微生物[39-41]。據報道，鏈霉菌可以被應用于促進豆類、苜蓿、小麥和水稻[42, 43]的生長。

表7?不同處理對3個水稻品種的病情指數及相對防效的影響

同一列不同小寫字母表示在< 0.05水平存在顯著差異。

Within a column, different letters indicate significant differences at the< 0.05 level.

本研究從不同生境的土壤中篩選得到拮抗能力較強的硫藤黃鏈霉菌() St-79。盆栽防效試驗表明，菌株St-79發酵濾液對水稻白葉枯病的相對防效可達65.95%～87.23%，病斑抑制率可達69.85%～95.8%，相比其他拮抗的微生物，如細菌BME17(防治效果為43.06%)[44]、枯草芽孢桿菌T429(防治效果為40.29%)、伯克氏菌T392(防治效果為45.56%)[3]、抗生素溶桿菌13-1(病斑抑制率為62.23%)[45]，菌株St-79發酵濾液的防治效果更好。促生試驗表明，菌株St-79發酵濾液可以顯著提高水稻種子的萌發率，且對水稻的各項生長指標都有促進作用。

目前，微生物生防作用的主要機制有拮抗作用、競爭作用、重寄生和溶菌作用、誘導植物抗病性等[46]。抗生素溶桿菌13-1能產生4種對水稻白葉枯病菌均具有抑菌活性的吩嗪類化合物，田間防效在60%以上[45]；芽孢桿菌Lx-11[47]能產生蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素，其中，嗜鐵素有利于Lx-11螯合土壤中的鐵離子，與病原菌展開營養競爭，抑制病原菌生長；枯草芽孢桿菌LJH25[48]對稻瘟病菌表現出很強的拮抗活性，通過掃描電鏡觀察發現，其對稻瘟病菌絲有溶解、斷裂、扭曲等致畸效應；李娟[49]發現枯草芽孢桿菌會分泌G87粗蛋白，其對稻惡苗病菌和稻瘟病菌的菌絲形態都有明顯的破壞作用，主要表現在病菌菌絲細胞畸形膨大、菌絲扭曲變形、原生質濃縮和外滲等；邵正英等[50]施加鏈霉菌JD211培育水稻，水稻培育31 d，水稻的PPO活性、總酚與類黃酮含量分別提高了5.68%、7.14%和18.59%，鏈霉菌JD211能夠誘導植物抗性，增強水稻抗病能力。本研究利用菌株St-79乙酸乙酯粗提物探究其對細胞抑制作用。結果顯示粗提物對菌體表現出很強的破壞作用，主要表現為細胞的破損與褶皺。因此，推測菌株St-79主要通過溶菌作用拮抗。考慮到乙酸乙酯粗提物中含有復雜的次級代謝產物，不能排除還有其他抑制機制的參與，本研究的重點是篩選一株拮抗的放線菌并對其促生效果、防效與抑菌作用進行初步探究，沒有進一步探究其更深層次的作用方式。為提供更多的菌株St-79防治水稻白葉枯病的理論依據，有必要進一步對菌株St-79乙酸乙酯粗提物中的活性成份分離純化，研究更深層次的作用機理，驗證其田間防治效果。

4?結論

本研究篩選得到一株拮抗的硫藤黃鏈霉菌St-79，后續利用菌株St-79發酵濾液對其促生作用及防效進行評估，結果顯示其發酵濾液對水稻各項生長指標都有促進作用，防效試驗中發酵濾液預防處理組相對防效高達87.23%，故該菌完全具備進一步開發成水稻白葉枯病生物防治劑的潛力。

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Control Effect of St-79 () on Rice Bacterial Blight and Its Growth-promoting Effect

MA Jingjing, PAN Yanyan, YANG Sunyuyue, WANG Jiaqi, JIANG Donghua*

(; Corresponding author,:)

【Objective】Rice bacterial blight (RBB) is one of the main bacterial diseases on rice, which seriously hinders rice production. The purpose of this study is to obtain an effective actinomycete against RBB and explore its biocontrol and growth-promoting effects, so as to lay a scientific basis for the development and utilization of biocontrol bacteria.【Method】Actinomycetes againstpv.() were screened by gradient dilution coating method, co-culture method and Oxford cup method. They were classified and identified by morphological traits, physiological and biochemical reactions, 16S rDNA sequences and phylogenetic-tree analysis. The antimicrobial spectrum of the target strain was analyzed by co-culture method. Antibacterial effect of the target strain was studied by 96-well microdilution method, scanning electron microscope and microbial adhesion hydrocarbon method; The promoting effect of fermentation liquid on rice growth was explored by soaking seeds and spraying soil. The control effect of fermentation liquid of the target strain on rice bacterial blight was studied in a pot experiment.【Result】A total of 140 actinomycetes strains were isolated from soil in different habitats, and one actinomycete strain St-79 with the strongest antagonistic activity againstwas finally screened. The diameter of inhibition zone of fermentation liquid was 64 mm, and it was identified as. The strain St-79 had antagonistic effects againstpv.,pv.,pv.andpv.. The ethyl acetate crude extract had good inhibitory effect on the growth of. The minimum inhibitory concentration of crude extract onwas 8 μg/mL, and the minimum bactericidal concentration was 32 μg/mL. The observation results under a scanning electron microscopy showed that the crude extract had a strong damage effect oncells. Crude extracts can also change the permeability ofcells and reduce the hydrophobicity ofcells. The results of growth-promoting test showed that the fermentation liquid of St-79 could promote the growth of rice seedlings. The pot experiment results showed that the fermentation liquid of St-79 had good control effect on RBB. The relative control efficacies on Nipponbare, Yongyou 15 and Yongyou 1540 was 65.95%－87.23%, and the lesion inhibition rate were 69.85%－95.8%. The prevention effect was better than the post-disease treatment.【Conclusion】An effective actinomycete against RBB was obtained, which had obvious inhibitory effect on RBB and could promote the germination and seedling growth of rice.

actinomycetes;;pv.; fermentation liquid; biocontrol; promoting growth

10.16819/j.1001-7216.2022.211102

2021-11-02；

2022-04-05。

國家自然科學基金資助項目(31570013)；浙江省基礎公益研究計劃資助項目(LGN22C140004)。