水稻直鏈淀粉合成調控新基因Wx410的功能與效應分析

毛慧 彭彥 毛畢剛 韶也 鄭文杰 胡黎明 周凱 趙炳然, *

水稻直鏈淀粉合成調控新基因的功能與效應分析

毛慧1, #彭彥2, #毛畢剛1, 2韶也2鄭文杰1胡黎明1周凱1趙炳然1, 2, *

(1湖南大學 研究生院隆平分院, 長沙 410125；2湖南雜交水稻研究中心/雜交水稻國家重點實驗室, 長沙 410125;#共同第一作者;*通信聯系人, email: brzhao652@hhrrc.ac.cn)

【目的】挖掘新等位變異，明確新等位基因對稻米品質性狀的影響。【方法】以Wx、Wx和Wx等位基因為模板，利用PCR進行第10外顯子第101位堿基的A-G單點突變，分別構建了不同等位背景下的定點突變植物表達載體pEGFC-Wx、pEGFC-Wx和pEGFC-Wx，陽性對照組載體分別為pEGFC-Wx、pEGFC-Wx和pEGFC-Wx。通過轉化糯稻品種蘇御糯，分析該位點的變異對稻米品質的遺傳效應。【結果】花后7 d和14 d，轉基因植株pEGFC-Wx410，pEGFC-Wx410及pEGFC-Wx410的胚乳基因表達量較各自的陽性對照材料無顯著變化，而顆粒結合淀粉合酶活性極顯著降低；轉基因植株直鏈淀粉含量較野生型顯著降低，而糊化溫度無明顯變化；pEGFC-Wx410及pEGFC-Wx410的膠稠度較各自的陽性對照材料顯著升高，而pEGFC-Wx410的膠稠度較其陽性對照材料顯著降低。【結論】pEGFC-為水稻淀粉合成的一個新的功能等位基因，控制的直鏈淀粉含量為4%～6%，剛好彌補了目前所鑒定的復等位基因所調控的直鏈淀粉含量在這個范圍內的空缺，為稻米食味和加工相關品質改良提供更豐富的遺傳資源。

水稻；基因；直鏈淀粉含量

水稻是世界上主要的糧食作物，全球一半以上人口以稻米為主食[1]。隨著人們生活品質的提高及稻米食品的日趨多樣化，與稻米食味和加工相關的品質性狀越來越受到廣泛的關注[2]。水稻胚乳中的淀粉分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉是α-1,4-糖苷鍵連接而成的葡萄糖聚合體，沒有或很少有分支。支鏈淀粉除含有以α-1,4-糖苷鍵連接而成的長鏈外，還包括以α-1,6-糖苷鍵連接而形成的葡萄糖聚合體分支，相對分子量較大[3]。一般認為，直鏈淀粉含量(amylose content, AC)是稻米蒸煮、食味及加工品質的決定因素[4,5]。基因編碼顆粒結合淀粉合酶(Granule Binding Starch Synthase Ⅰ, GBSSⅠ)，是控制稻米胚乳直鏈淀粉含量的關鍵基因[6-8]。基因表達量與稻米胚乳直鏈淀粉含量呈正相關，基因復等位變異是導致水稻直鏈淀粉含量變異最主要的原因[4]。目前在水稻中共發掘了8個重要的等位基因[9]，其中攜帶基因的糯稻不含或只含很少的直鏈淀粉[10]，而在非糯稻品種中，基因主要以Wx、Wx和Wx三種等位的形式存在，分別對應高、中和中低直鏈淀粉含量[11-12]。Wx為祖先等位基因，該等位表現為高直鏈淀粉含量和低淀粉黏滯特性[13]。此外，一系列控制低直鏈淀粉含量的軟米基因Wx、Wx和Wx在食味品質改良方面發揮重要作用[14-18]。因此，對基因等位變異的發掘與利用是稻米品質改良的基礎。

本研究前期利用全球3000份水稻基因組計劃(3K RGP)的重測序數據，開展了水稻基因的等位變異分析[19]，其中來源于印度的種質資源C105（Aus稻），該等位第10外顯子的第101位堿基由A突變為G，導致氨基酸由Glu突變為Gly(410)。OsGBSS Ⅰ蛋白晶體結構顯示Glu410Gly(Ex10+101)位于酶的活性中心，與OsGBSS Ⅰ的配體ADP相鄰，該位點的突變很可能會影響酶的活性。進一步對其成熟種子進行直鏈淀粉含量的測定，發現含有的材料直鏈淀粉含量為5%左右，較野生型(直鏈淀粉含量25%)低。

現有的栽培稻品種直鏈淀粉含量差異大，其中糯稻僅為0%～2%，非糯稻為8%～30%，這些差異主要是由不同的等位變異引起的[9]。因此，如果是一個新的功能等位，其調控的直鏈淀粉含量位于糯稻(0%～2%)和軟米(8%～10%)之間，4%～6%的直鏈淀粉含量剛好能彌補目前已知復等位基因所調控直鏈淀粉含量在這個范圍內的空缺。本研究通過PCR擴增Wx、Wx和Wx等位基因，并進行第10外顯子的第101位堿基的A-G突變，分別構建Wx，Wx和Wx等位背景下的定點突變植物表達載體，通過轉化糯稻“蘇御糯”，分析該位點的變異對稻米品質的遺傳效應。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用水稻材料C105(攜Wx基因)、V20B(Wx)、日本晴(Wx)及轉基因受體蘇御糯()均由雜交水稻國家重點實驗室提供，所有材料統一種植于湖南雜交水稻研究中心春華基地。

1.2 Wx410的克隆及載體的構建

采用CTAB法提取C105、V20B、日本晴葉片的DNA；以日本晴基因組為參考序列設計基因全長及啟動子擴增引物、和（表1）。基因全長及啟動子序列分三段擴增，擴增產物利用ClonExpress? MultiS One Step Cloning 試劑盒（vazyme，C113-01）連接到植物表達載體pEGFC上，構建陽性對照組載體pEGFC-Wx、pEGFC-Wx和pEGFC-Wx，以pEGFC空載體作為陰性對照；利用Mut Express? II Fast Mutagenesis試劑盒（Vazyme，C214-01）在基因第10外顯子的第101位堿基處引入A-G突變。啟動子序列和點突后的全長基因利用試劑盒連接到植物表達載體pEGFC上，構建不同等位背景下的點突變植物表達載體pEGFC-Wx、pEGFC-Wx和pEGFC-Wx。

1.3 T1代轉基因純合植株鑒定

取水培兩周的T1代轉基因植株的葉片提取總DNA，根據蘇御糯的基因第2外顯子中的23 bp核苷酸插入設計KASP1分型標記來鑒定轉基因陽性對照T1純合植株；根據第10外顯子的第101位的SNP設計KASP2分型標記(序列見表1)來鑒定定點突變純合植株。

1.4 Wx基因的表達量分析

利用植物RNA小量提取試劑盒（HiPure）提取純合轉基因植株及野生型花后7 d和14 d的胚乳的RNA，利用熒光定量PCR分析基因總mRNA表達量。以日本晴基因組為參考序列設計基因熒光定量PCR引物qWx及內參引物qActin和qHyg。其中熒光定量PCR在Roche Light Cycler 480中進行，反應體系包括：cDNA模板1 μL (20～30 ng/μL)、PerfectStart Green qPCR Super Mix(全式金)10 μL、x-qPCR正反引物各0.4 μL(10 μmol/L)，加水補齊20 μL。qPCR運行程序包括：94℃下15 min；94℃下5 s；61℃下30 s，共45個循環。循環結束后進行熔解曲線分析。

1.5 GBSSⅠ酶活性測定

在超凈工作臺上取0.10 g凍存于管中的胚乳樣品，并快速放進裝有液氮的研缽中充分研磨，按照顆粒結合態淀粉合成酶（OsGBSSⅠ）活性檢測試劑盒（Solarbio，BC3290）的說明書加入相應的試劑后混勻，立即在340 nm波長下記錄初始吸光度1和2 min后的吸光度2，GBSSⅠ酶活性=43.2×（2?1÷, 其中為胚乳質量。

表1 本研究所用引物

1.6 大米直鏈淀粉含量和大米膠稠度測定

直鏈淀粉含量和大米膠稠度的測定按照農業部頒布標準《米質測定方法》(NY147―88)進行。

1.7 大米糊化溫度測定

參照Zhang等[20]的方法，利用差示掃描量熱儀(DSC法)測定糊化溫度，重復2次取均值。

1.8 數據整理與分析

使用SPSS 1.6軟件整理數據并進行差異顯著性分析，采用Excel Office 2009軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 Wx410植物表達載體的構建及遺傳轉化

利用CTAB法提取秈稻品種C105、V20B以及粳稻品種日本晴的葉片DNA，并以其為模板，擴增基因全長序列和啟動子序列；利用PCR擴增對基因第10外顯子101位的堿基進行點突變(A-G)；啟動子序列和點突后的基因全長序列通過同源重組連接至植物表達載體pEGFC質粒中(圖1)。利用農桿菌介導法轉化蘇御糯，設計潮霉素磷酸轉移酶基因引物qHyg(表1)，采用PCR擴增鑒定T0代轉基因陽性植株。分別獲得Wx，Wx和Wx背景的轉基因T0陽性植株21、23和24株。

2.2 轉基因T1代純合植株表型比較

利用KASP標記鑒定T1代轉基因株系里的純合植株（圖2），考查其農藝性狀。結果表明，不同轉基因系在株高、有效穗數、每穗總粒數、結實率、千粒重等農藝性狀上無顯著性變化，但在精米長寬比上有一定差異(表1)。不同轉基因系較陽性對照材料透明度顯著降低，但相對于陰性對照，pEGFCWx410的籽粒較透明，pEGFCWx410的籽粒次之，pEGFCWx410差異不大(圖3)。

M―DNA標記；泳道1～17―不同Wx410轉基因系潮霉素檢測；泳道18～24―對照材料潮霉素檢測。

Fig. 1. Schematic diagram oftargeted mutant plant expression vector under differentallelic backgrounds and identification of T0transgenic plants.

A?分子標記KASP1鑒定轉基因T1代陽性對照植株(基于wx第2外顯子中的23 bp核苷酸插入)；B?分子標記KASP2鑒定Wx410定點突變轉基因系純合植株(基于Wx基因第10外顯子的第101位的SNP A-G)；綠色、藍色、紅色和灰色點分別代表轉基因受體、純合系、雜合材料和水。

Fig. 2.genotyping of transgenic T1generation materials.

表2 轉基因材料及對照材料的農藝性狀比較

pEGFC―陰性對照; pEGFCWx，pEGFCWx和pEGFCWx―陽性對照; pEGFCWx410, pEGFCWx410和pEGFCWx410―不同等位背景下的定點突變轉基因系; 同列數據后跟相同字母者表示差異未達0.05顯著水平。

pEGFC, Negative control; pEGFC-Wx, pEGFCaand pEGFC-Wx, Positive control; pEGFC-Wx410, -Wx410and -Wx410,targeted mutant transgenic lines under differentallelic backgrounds; Data followed by the same letters in the same column indicate no difference at 0.05 significance level.

圖3 轉基因植株籽粒外觀比較

Fig. 3. Comparison of grain appearance of transgenic plants.

2.3 轉基因T1純合植株胚乳Wx基因相對表達量

分別提取轉基因T1代純合植株與轉基因對照材料花后7 d和14 d水稻胚乳RNA，利用熒光定量PCR進行基因總mRNA表達分析。圖4顯示，花后7 d及花后14 d，轉基因受體蘇御糯的基因表達量極低，pEGFCWx410，pEGFCWx410及pEGFCWx410胚乳基因表達量依次降低，但較各自轉基因陽性對照材料均無顯著差異。

2.4 轉基因T1代純合植株胚乳GBSSⅠ酶活分析

利用結合態淀粉合成酶(OsGBSSⅠ)活性檢測試劑盒，進行轉基因T1代純合植株與轉基因對照材料花后7 d和14 d水稻胚乳OsGBSSⅠ活性分析。花后7 d及14 d，轉基因受體蘇御糯胚乳中的OsGBSSⅠ活性極低，pEGFCWx410，pEGFCWx410及pEGFCWx410胚乳OsGBSSⅠ酶活性較各自轉基因對照材料極顯著降低（圖5）。

2.5 轉基因T1代純合植株胚乳理化性狀分析

測定轉基因T1代純合植株與轉基因對照材料成熟籽粒的直鏈淀粉含量、膠稠度和糊化溫度（圖6）。結果顯示，轉基因材料較陽性對照材料的直鏈淀粉含量均顯著下降，其中pEGFCWx410和pEGFCWx410的直鏈淀粉含量較高(約6%)，位于軟米與糯稻之間，pEGFCWx410直鏈淀粉含量次之。轉基因植株較對照材料的膠稠度也有顯著變化，其中pEGFCWx410顯著降低，pEGFCWx410和pEGFCWx410則表現為顯著上升；轉基因植株較對照材料的糊化溫度無明顯變化。

A―花后7 d; B―花后14 d; 均值±標準差，n=3。pEGFC―陰性對照; pEGFC-Wxlv，pEGFC-Wxa和pEGFC-Wxb―陽性對照; pEGFC-Wxlv410，pEGFC-Wxa410和pEGFC-Wxb410―不同Wx等位背景下的Wx410定點突變轉基因系。下同。

Fig. 4. Determination of relative expression level ofgene at different time after anthesis.

A―花后7 d; B―花后14 d; 均值±標準差，n=3；*和**分別表示Wx410定點突變轉基因系與其陽性對照在0.05和0.01水平上差異顯著（t檢驗）。

Fig. 5. OsGBSSⅠactivity in endosperm at different time after anthesis.

均值±標準差，n=3；**表示Wx410定點突變轉基因系與其陽性對照在0.01水平上差異顯著（t檢驗）。

Fig. 6. Determination of endosperm physical and chemical properties of transgenic plants.

3 討論

本研究通過分析這一變異位點在Wx，Wx和Wx等位背景下的遺傳效應，證實了是一個控制低直鏈淀粉含量的新的功能等位變異。已有研究表明基因的表達量、OsGBSSⅠ的酶活性與稻米胚乳直鏈淀粉含量呈顯著正相關[9]，本研究中花后7 d和14 d轉基因植株較對照材料胚乳基因表達量無顯著性變化，而花后7 d和14 d轉基因材料胚乳OsGBSSⅠ酶活性較對照材料均顯著降低，這是導致pEGFCWx410，pEGFCWx410和pEGFCWx410籽粒直鏈淀粉較野生型均顯著降低的原因。OsGBSS1的晶體結構解析顯示Lys413和Arg408是兩個重要的與ADP直接作用的氨基酸，而Glu410與這兩個氨基酸通過氫鍵直接相連[19]，因此，我們推測位點的突變(Glu410Gly)會直接影響酶活。已有研究通過對OsGBSSⅠ活性中心的8個氨基酸(包括Glu410)進行人工點突來分析OsGBSSⅠ活性，發現Glu410Asp和Glu410Gln均導致直鏈淀粉含量降低[21]。本研究中的Glu410Gly是一新的自然等位變異，該突變導致原本的酸性氨基酸Glu被R基團缺失的非極性氨基酸Gly所取代，相比于前人的研究，這種類型的變異對Lys413和Arg408的構象可能會產生更大的影響，因此AC含量下降更多。

本研究中不同轉基因系表現出了不同的直鏈淀粉含量，這主要是由于不同等位背景的影響。一般而言，Wx具有較高的表達量，OsGBSSⅠ酶活及直鏈淀粉含量，Wx次之，Wx最低，而受體蘇御糯胚乳中的是基因座的隱性突變，在水稻發育種子中不能正常表達[11]。因此，我們的研究表明，pEGFC中的Glu410Gly突變，在不同的等位背景下還表現出不同的遺傳效應，其中Wx和Wx背景下的Glu410Gly突變導致直鏈淀粉含量升高。基因除了控制直鏈淀粉含量外，對稻米膠稠度也有一定的影響[4]。本研究中pEGFCWx410，pEGFCWx410，pEGFCWx410及受體材料蘇御糯的直鏈淀粉含量依次降低，而膠稠度依次升高，這與以往的研究相符[22]。

近年來，很多研究者利用基因組編輯技術來創制新的等位變異。Zhang等[23]在粳稻（Wx）品種中引入功能缺失的突變，使稻米淀粉下降到糯米的含量，且未影響其他的農藝性狀；Huang等[24]通過編輯Wx啟動子上的關鍵順式作用元件，進而下調表達并微調籽粒直鏈淀粉含量，產生了6個新的等位基因，其中一個株系后代性狀表現穩定，有育種潛力；Zeng等[25]發現在5′UTR內編輯外顯子/內含子邊界序列可以定量地調節基因活性從而調控直鏈淀粉含量，導致攜帶Wx等位基因的植株AC顯著減少，得到了中等水平直鏈淀粉含量的種質以及新的有價值的軟米種質；還有學者利用新的單堿基替換技術，在基因第2、6和8個外顯子的靶位點上將腺嘌呤(A)替換為鳥嘌呤(G)，成功編輯了秈稻品種中嘉早17的Wx等位基因，成功降低AC，改善秈稻品種的食用品質[26]。CRISPR/Cas9介導的基因表達調控加快了等位基因的創制，有助于加快水稻品質的遺傳育種改良。

除了糯稻中的外，Wx是目前發現的非糯稻中控制最低直鏈淀粉含量(約9%)的等位基因[18]，本研究發現的彌補了糯稻到軟米之間的等位基因空白，進一步豐富了等位變異和栽培稻直鏈淀粉含量的多樣性。

[1] 方志強, 陸展華, 王石光, 劉維, 盧東柏, 王曉飛, 何秀英. 稻米品質性狀研究進展與應用[J]. 廣東農業科學, 2020, 47(5): 11-20.

Fang Z Q, Lu Z H, Wang S G, Liu W, Lu D B, Wang X F, He X Y. Research advances and applications of rice grain quality traits[J]., 2020, 47(5): 11-20. (in Chinese with English abstract)

[2] Yang X H, Nong B X, Xia X Z, Zhang Z Q, Zeng Y, Liu K Q, Deng G F, Li D T. Rapid identification of a new gene influencing low amylose content in rice landraces (L.) using genome-wide association study with specific-locus amplified fragment sequencing[J]., 2017, 60(6): 465-472.

[3] Buléon A, Colonna P, Planchot V, Ball S. Starch granules: Structure and biosynthesis[J]., 1998, 23(2): 85-112.

[4] Tian Z X, Qian Q, Liu Q Q, Yan M X, Liu X F, Yan C J, Liu G F, Gao Z Y, Tang S Z, Zeng D L, Wang Y H, Yu J M, Gu M H, Li J Y. Allelic diversities in rice starch biosynthesis lead to a diverse array of rice eating and cooking qualities[J]., 2009, 106(51): 21760-21765.

[5] Juliano B O, Pascual C G. Differences in physicochemical properties of commercial rice from urban markets in West Africa[J]., 2020, 57(4): 1505-1516.

[6] Wang Z Y, Zheng F Q, Shen G Z, Gao J P, Snustad D P, Li M G, Zhang J L, Hong M M. The amylose content in rice endosperm is related to the post-transcriptional regulation of thegene[J]., 1995, 7(4): 613-622.

[7] Gu M H, Liu Q Q, Yan C J, Tang S Z. Genetic variation and molecular improvement accelerating hybrid rice development// International Rice Research Institute. Grain quality of hybrid rice[M]. Los Banos (Philippines): International Rice Research Institute, 2010: 345-356.

[8] Ball, S G, van de Wal M H, Visser R G. Progress in understanding the biosynthesis of amylose[J]., 1998, 3(12): 462-467.

[9] 朱霽暉, 張昌泉, 顧銘洪, 劉巧泉. 水稻基因的等位變異及育種利用研究進展[J]. 中國水稻科學, 2015, 29(4): 431-438.

Zhu J H, Zhang C Q, Gu M H, Liu Q Q. Progress in the Allelic variation ofgene and its application in rice breeding[J]., 2015, 29(4): 431-438. (in Chinese with English abstract)

[10] Suu T D, Hoai T T T, Hoa N T L, Loan H M, Yen D B. Kumamaru T, Satoh H. Variation on grain quality in Vietnamese rice cultivars[J]., 2012, 57(2): 365-371.

[11] Sano Y, Katsumata M, Okuno K. Genetic studies of speciation in cultivated rice: 5. Inter-and intraspecific differentiation in thegene expression of rice[J]., 1986, 35(1): 1-9.

[12] Mikami I, Uwatoko N, Ikeda Y, Yamaguchi J, Hirano H Y, Suzuki Y, Sano Y. Allelic diversification at thelocus in landraces of Asian rice[J]., 2008, 116(7): 979-989.

[13] Zhang C Q, Zhu J H, Chen S J, Fan X L, Li Q F, Lu Y, Wang M, Yu H X, Yi C D, Tang S Z, Gu M H, Liu Q Q.Wx, the ancestral allele of ricegene[J]., 2019, 12(8): 1157-1166.

[14] Zhang C Q, Yang Y, Chen S J, Liu X J, Zhu J H, Zhou L H, Lu Y, Li Q F, Fan X L, Tang S Z, Gu M H, Liu Q Q. A rareallele coordinately improves rice eating and cooking quality and grain transparency[J]., 2021, 63(5): 889-901.

[15] Zhou H, Xia D, Zhao D, Li Y H, Li P B, Wu B, Gao G J, Zhang Q L, Wang G W, Xiao J H, Li X H, Yu S B, Lian X M, He Y Q. The origin ofWxprovides new insights into the improvement of grain quality in rice[J]., 2021, 63(5): 878-888.

[16] Sato H, Suzuki Y, Sakai M, Imbe T. Molecular characterization ofWx, a novel mutant gene for low-amylose content in endosperm of rice (L.)[J]., 2002, 52(2): 131-135.

[17] Mikami I, Aikawa M, Hirano H Y, Sano Y. Altered tissue-specific expression at thegene of the opaque mutants in rice[J]., 1999, 105(2): 91-97.

[18] Liu L L, Ma X D, Liu S J, Zhu C L, Jiang L, Wang Y H, Shen Y, Ren Y L, Dong H, Chen L M, Liu X, Zhao Z G, Zhai H Q, Wan J M. Identification and characterization of a novelallele from a Yunnan rice landrace[J]., 2009, 71(6): 609-626.

[19] Shao Y, Peng Y, Mao B G, Lü Q M, Yuan D Y, Liu X, Zhao B R. Allelic variations of thelocus in cultivated rice and their use in the development of hybrid rice in China[J]., 2020, 15(5): e0232279.

[20] Zhang C Q, Chen S J, Ren X Y, Lu Y, Liu D R, Cai X L, Li Q F, Gao J P, Liu Q Q. Molecular structure and physicochemical properties of starches from rice with different amylose contents resulting from modification of OSGBSSⅠ activity[J]., 2017, 65(10): 2222-2232.

[21] Liu D R, Wang W, Cai X L. Modulation of amylose content by structure-based modification of OsGBSSⅠ activity in rice (L)[J]., 2014, 12(9): 1297-1307.

[22] 萬映秀, 鄧其明, 王世全, 劉明偉, 周華強, 李平. 水稻基因的遺傳多態性及其與主要米質指標的相關性分析[J]. 中國水稻科學, 2006, 20(6): 603-609.

Wan Y X, Deng Q M, Wang S Q, Liu M W, Zhou H Q, Li P. Genetic polymorphism ofgene and its correlation with major grain quality traits in rice[J]., 2006, 20(6): 603-609. (in Chinese with English abstract)

[23] Zhang J S, Zhang H, Botella J R, Zhu J K. Generation of new glutinous rice by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of thegene in elite rice varieties[J]., 2018, 60(5): 369-375.

[24] Huang L C, Li Q F, Zhang C C, Chu R, Gu Z W, Tan H Y, Zhao D S, Fan X L, Liu Q Q. Creating novelalleles with fine-tuned amylose levels and improved grain quality in rice by promoter editing using CRISPR/Cas9 system[J]., 2020, 18(11): 2164-2166.

[25] Zeng D C, Liu T L, Ma X L, Wang B, Zheng Z Y, Zhang Y L, Xie X R, Yang B W, Zhao Z, Zhu Q L, Liu Y G. Quantitative regulation ofexpression by CRISPR/Cas9-based promoter and 5' UTR-intron editing improves grain quality in rice[J]., 2020, 18(12): 2385-2387.

[26] Monsur M B, Cao N, Wei X J, Xie L H, Jiao G A, Tang S Q, Nese S, Shao G N, Hu P S. Improved eating and cooking quality of indica rice cultivar YK17 via adenine base editing ofWxallele of granule-bound starch synthase I (GBSS I)[J]., 2021, 28: 427-430.

Function and Effect Analysis of a New GeneRegulating Amylose Synthesis in Rice

MAO Hui1,#, PENG Yan2,#, MAO Bigang1,2, SHAO Ye2, ZHENG Wenjie1, HU Liming1, ZHOU Kai1, ZHAO Bingran1,2,*

(1Longping Branch of Graduate School, Hunan University, Changsha 410125, China;2Hunan Hybrid Rice Research Center/State Key Laboratory of Hybrid Rice, Changsha 410125, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, email: brzhao652@hhrrc.ac.cn)

【Objective】Miningnew allelic variants of thegene and identifying the effect of the newallele on rice quality traits. 【Method】UsingWx,WxandWxalleles as templates, the A-G point mutation at base 101 of exon 10 was performed by PCR,andsentinel mutation plant expression vectors in differentallelic backgrounds (pEGFC-Wx410, pEGFC-Wx410and pEGFC-Wx410)were constructed respectively, and the genetic effect of the variation at this locus on rice quality was analyzed by transforming the glutinous rice variety Suyunuo. 【Results】The expression level of thegene in the endosperm of the transgenic plants pEGFC-Wx410, pEGFC-Wx410and pEGFC-Wx4107 and 14 days after flowering was not significantly different from that of the positive control, while the activity of GBSS Ⅰwas highly significantly lower than that of the positive control. The transgenic plants had significantly lower amylose content in mature seeds compared to the wild-type. pEGFC-Wx410and pEGFC-Wx410had significantly higher gelatinous consistency and pEGFC-Wx410had significantly lower gelatinous consistency of endosperm compared to the positive control. 【Conclusion】is a new functional allele for starch synthesis in rice. The allele explains 4%?6% of amylose content variation, which just fills the gap in the range of amylose content regulated by the currently identified complex alleles, providing a richer genetic resource for rice taste and processing-related quality improvement.

rice;gene; amylose content

2022-01-06；

2022-03-14。

國家自然科學基金聯合基金項目(U19A2032)；湖南省自然科學基金資助項目(2020JJ5401)；現代農業產業技術體系建設專項資金資助項目(CARS-01-14)。

10.16819/j.1001-7216.2022.220103