水稻二化螟病原線蟲N-Yz1的分離鑒定及其感染特性

劉琴 夏楊 韓光杰 李傳明 陸玉榮 黃立鑫 祁建杭 徐健, *

水稻二化螟病原線蟲N-Yz1的分離鑒定及其感染特性

劉琴1, 2夏楊2韓光杰2李傳明2陸玉榮2黃立鑫2祁建杭1徐健2, *

(1揚州綠源生物化工有限公司，揚州 225008；2江蘇里下河地區農業科學研究所/國家農業微生物揚州觀測實驗站，揚州 225007；*通信聯系人，email: bio-xj@163.com)

【目的】二化螟是危害水稻的重要害蟲，其鉆蛀為害，防治困難，嚴重威脅水稻生產。本研究對感染二化螟昆蟲病原線蟲的分離篩選和感染特性進行研究，期望為水稻鉆蛀害蟲危害的防治提供新的途徑和方法。【方法】自越冬代二化螟幼蟲體內通過組織分離篩選，獲得野外感染二化螟的昆蟲病原線蟲，室內接種實驗分析分離昆蟲病原線蟲對二化螟的感染活性和作用特性?！窘Y果】自然罹死二化螟幼蟲體內分離獲得野外感染的昆蟲病原線蟲N-Yz1，接種4齡二化螟幼蟲導致感染并死亡，后期蟲體內產生大量形態一致的侵染期線蟲(IJ)。形態學觀察結合rDNA-ITS序列分析，鑒定分離昆蟲病原線蟲隸屬于斯氏線蟲屬，與已鑒定種小卷蛾斯氏線蟲同源性達99.87%。昆蟲病原線蟲N-Yz1對不同齡期二化螟幼蟲都有較高感染致死作用，40頭(IJ)的線蟲接種劑量，對低齡(2～3齡)二化螟致死速度快、致死率高，接種2 4 h 就出現感染致死個體，48 h后幼蟲全部死亡。高齡幼蟲(4～6齡)感染致死速度較慢，死亡高峰發生在接種線蟲后的48 h。N-Yz1接種劑量與二化螟死亡率呈顯著正相關，劑量超過30 IJs/頭時，4齡二化螟感染死亡率達90%以上。N-Yz1對二化螟幼蟲具有明顯搜索能力，在距離寄主害蟲0-30 cm的范圍內，通過遷移擴散，感染二化螟并導致其死亡?！窘Y論】分離昆蟲病原線蟲N-Yz1具有較強的感染致死能力，表現出防治水稻鉆蛀害蟲二化螟的潛在應用價值。

二化螟；斯氏線蟲；分離鑒定；感染特性

二化螟()是危害水稻的重要害蟲，幼蟲在葉鞘和莖稈內鉆蛀為害, 造成水稻枯鞘、枯心、白穗及蟲傷株，給水稻產量造成嚴重損失[1]。長期以來，二化螟防治上主要依賴具有內吸、滲透作用的化學農藥。但由于害蟲以幼蟲鉆蛀莖稈內部取食危害，防治困難，長期大量的化學農藥使用未能有效控制害蟲危害，而且造成害蟲抗性增強、農殘、害蟲再猖獗，成為制約水稻綠色安全生產的瓶頸[2]。在當前農藥減量使用、安全高效生產的需求形勢下，亟待針對二化螟等鉆蛀性害蟲開展安全、高效的生物防治技術研究，保障水稻高質量生產。昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic nematodes)是昆蟲的?；约纳鞌?，其腸道攜帶共生菌，以3齡侵染期蟲態(Infective Juveniles, IJs)存活于土壤和水體中。侵染期線蟲通過昆蟲表皮的自然開口(口器、氣孔、肛門等)、傷口或節間膜侵入寄主體內，在昆蟲血腔中釋放其腸道共生細菌，共生菌增殖并產生毒素而導致昆蟲死亡，線蟲則以共生菌細胞和蟲體組織為營養生長繁殖產生下一代侵染期幼蟲[3]。由于昆蟲病原線蟲資源廣泛、寄主范圍廣、侵染致死率高、環境生態安全、不易產生抗性、可規模培養，在害蟲生物防治中表現出重要的研究價值和應用潛力[4]。同時，昆蟲病原線蟲可借助水膜進行水平和垂直運動，通過感知寄主呼吸產生的CO2等氣味而主動搜尋和侵染隱蔽害蟲[5, 6]，對亞洲玉米螟()、光肩星天牛()、黃條跳甲()等鉆蛀性和土棲性害蟲表現出特殊防治效果[7-9]。二化螟是鉆蛀危害水稻的重要害蟲，然而昆蟲病原線蟲感染水稻鉆蛀害蟲二化螟的研究卻鮮見報道。本研究通過對野外二化螟越冬種群中感染害蟲病原物的調查，自罹死幼蟲體內分離篩選感染二化螟的昆蟲病原線蟲。通過形態學結合分子生物學方法鑒定感染二化螟的昆蟲病原線蟲，進一步分析昆蟲病原線蟲對二化螟幼蟲的感染致死作用和侵染特性，探索應用昆蟲病原線蟲防治水稻二化螟的潛在價值，為水稻鉆蛀害蟲的防治提供新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 感病二化螟蟲源

感染線蟲的二化螟蟲源采集自揚州市郊方巷鎮稻田。于春季越冬代二化螟羽化前在其為害田塊整穴挖取稻茬，室內剝查自然罹死幼蟲。收集蟲體完整、臃腫柔軟、體色棕褐、呈癱瘓狀的罹死蟲尸，75%乙醇處理30 s、1% NaClO溶液表面消毒5 min后，單頭置于預先鋪有濾紙的消毒培養皿中，加入適量無菌水濕潤濾紙以保濕，置于20℃生化培養箱中培養10 d，用于二化螟感染昆蟲病原線蟲的檢查和分離。

1.1.2 測試昆蟲

試驗昆蟲二化螟采集自揚州郊區，在溫度25±1℃、相對濕度70%條件下，以人工飼料飼養多代繁殖[10]，挑選蟲體健康、大小一致的2齡至6齡幼蟲供試。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原線蟲的分離和增殖

田間采集的單頭自然罹死二化螟完整蟲體置于解剖鏡下，觀察蟲體組織內是否有線蟲體蠕動。將蟲體置于滴加5 mL無菌水的培養皿中央，以昆蟲針輕輕刺破蟲體皮層，低倍顯微鏡觀察大量蠕動的400～500 μm的線蟲自蟲體內游離到無菌水中，判定為感染期線蟲(IJs)。收集線蟲液，500 r/min下離心3 min，沉淀以無菌水懸浮并反復離心洗滌數次，顯微鏡檢觀察，獲得形態、大小一致的昆蟲病原線蟲。以無菌水懸浮收集線蟲并在顯微鏡下計數，使終濃度達1000 IJs/mL，置4℃冰箱中保存備用。

昆蟲病原線蟲的增殖以二化螟接種分離線蟲培養。直徑9 cm培養皿中鋪墊濾紙并加無菌水濕潤，接入4齡二化螟幼蟲10頭，隨后每皿中央滴加1 mL分離昆蟲病原線蟲懸浮液，皿口以保鮮帶封口后置于25℃生化培養箱中培養，48 h后收集死亡蟲體，體表消毒后置于濕潤濾紙的消毒培養皿中。根據預備實驗結果，于20 ℃生化培養箱中培養20 d后，將死蟲體置于培養皿中央并刺破皮，加入5 mL無菌水，并輕輕晃動，使感染期線蟲游離到無菌水中。收集皿中液體，離心洗滌后以無菌水懸浮使終濃度達到1×104IJs/mL，4 ℃下保存。另取培養3 d的死亡蟲體分離線蟲成蟲用以觀察線蟲形態。

1.2.2 病原線蟲的形態觀察

參考張喆等[11]的方法，解剖鏡下以移液器吸取線蟲置于載玻片上，60 ℃下處理5 min使線蟲死亡。用FA固定液固定線蟲，置于Zeiss Axio Vert.A1熒光倒置顯微鏡下進行形態特征觀察和測量。感染期、雄蟲、雌蟲等不同蟲態各隨機觀測10頭，計算主要參數平均數，通過線蟲多歧檢索表檢索[12]，初步鑒定感染二化螟病原線蟲種類。

1.2.3 病原線蟲的分子生物學鑒定

取單頭線蟲加到含有20 μL預冷蛋白酶K的WLB溶液的離心管中，70 ℃下孵育1 h后，95 ℃下15 min使蛋白酶K失活，12000 r/min離心10 min，取上清液，用愛思進基因組提取試劑盒(Axygen?AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取線蟲總DNA。選擇核糖體內轉錄間隔區間的基因序列(ITS)作為分子特征，設計rDNA-ITS序列引物進行PCR擴增(F-18S: 5'-TTGAT TACGTCCCTGCC CTTT-3', R-26S: 5'-TTTCACTCG CCGTTACTAAG G-3)[13]，反應程序為95 ℃下5 min；95 ℃下30 s；53 ℃下30 s；72 ℃下90 s；30個循環；72 ℃下10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序。測序得到的序列與GenBank數據庫中的核苷酸序列進行BLAST分析，選取多個品種的線蟲已知序列，用MEGA6軟件進行多序列同源性比對，采用最大似然法(ML)構建系統發育樹，進一步判定其分類地位。

1.2.4 病原線蟲對二化螟幼蟲的感染

直徑9 cm培養皿內墊1層濾紙，加1 mL無菌水濕潤，每皿分別接入2、3、4、5、6齡二化螟幼蟲20頭后，濾紙中央滴加1×104IJs/mL的增殖線蟲懸浮液80 μL，使每皿線蟲劑量(線蟲/二化螟)達40 IJs/頭，每處理重復3次，另以清水處理為對照。保鮮帶封口后置于25℃生化培養箱中培養，間隔12 h檢查并記錄幼蟲死亡數(死蟲單獨培養5 d顯微鏡檢，確定線蟲感染致死)，繪制存活曲線。

接入4齡二化螟幼蟲10頭的培養皿中，按線蟲劑量10、20、30、40、50 IJs/頭分別接種于濕潤濾紙中央，不同線蟲劑量處理重復3次，另以無菌水處理為對照。不同處理培養皿置于25 ℃下培養，48 h計算死亡率，比較線蟲不同劑量對二化螟的致死作用。

20目不銹鋼紗網卷成直徑1 cm的管狀，內接4齡二化螟10頭，以棉花塞封堵2端。保鮮盒底部平鋪1層濾紙，加適量無菌水濕潤，一端滴加40 IJs/頭劑量的線蟲，另一端放置接入二化螟的紗網管，使二化螟與線蟲距離分別為5、10、20、30 cm。每處理重復3次。另以無菌水處理為對照，48、72 h檢查二化螟感染死亡率，計算線蟲的搜尋感染作用。

1.2.5 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2016處理數據；用SPSS軟件進行數據統計和分析；圖形制作使用GraphPad Prism軟件。

2 結果與分析

2.1 二化螟病原線蟲的分離和形態觀察

解剖鏡下逐頭觀察自然罹死二化螟幼蟲，在體色棕褐、臃腫柔軟的蟲尸中發現線狀蟲體蠕動。顯微鏡下可見死亡蟲體表皮破損處游離出首尾卷曲游動的線蟲，并隨體液擴散到無菌水中，初步判定為感染二化螟的病原線蟲(N-Yz1)(圖1)。分離純化的N-Yz1可以感染4齡二化螟幼蟲并導致其死亡。死蟲體腫脹癱瘓，體色由初期淡褐色逐步變為深褐色(圖2)。死亡3 d后蟲體內發現雌雄異體的成熟線蟲。雄蟲體長為1675.22 μm，體寬為127.23 μm，頭部有乳頭狀刺突，頭至排泄孔距離為81.27 μm，頭至咽距離(ES)為163.27 μm。線蟲尾端有刺，交合刺(SL)呈足形，長67.11 μm，刺頭寬大于長(圖3 A～C)。雌蟲個體較大，長5827.96μm，寬207.48 μm，陰門位于中部，EP約152.92 μm(圖3-D～E)。感染二化螟死亡20 d后，蟲體中出現大量形態相對一致的侵染期線蟲，體長為492.94 μm，體寬為25.93 μm，尾長為60.23 μm，頭至排泄孔距離約為35.92 μm(圖3 F, G)。對照線蟲分類表，形態學符合斯氏線蟲屬Steinernema，主要特征參數與小卷蛾斯氏線蟲()相似(表1)。

2.2 病原線蟲N-Yz1的分子鑒定

以抽提分離線蟲N-Yz1的基因組DNA為模板，PCR擴增rDNA-ITS序列，獲得分子量大小為1250 bp片段，包含核糖體18S的3＇端、ITS1、5.8S rRNA、ITS2和28S的5＇端，GeneBank登錄號OM421679。對目的片段克隆測序并在 NCBI上進行序列同源性比對發現，該線蟲與斯氏線蟲屬的小卷蛾斯氏線蟲()片段序列的同源性高達99.89%，推測分離二化螟病原線蟲N-Yz1屬斯氏線蟲屬。利用 MEGA6.0軟件，使用最大似然法(ML)，將分離線蟲rDNA-ITS序列與GenBank中已登錄的22種同源性相近的斯氏線蟲序列構建系統發育樹，核酸替代模型為HKY+G，自展值設定為1000。結果表明，N-Yz1與種處于同一分支，親緣關系最近。綜合形態學特征和分子生物學鑒定結果，確定感染二化螟的病原線蟲N-Yz1為小卷蛾斯氏線蟲()(圖4)。

A－感染致死二化螟幼蟲；B－體內游離線蟲。

Fig. 1. Naturally lethed larvae ofand parasitic nematodes in the tissue.

A－健康幼蟲蟲態；B－接種感染死亡幼蟲蟲態。

Fig. 2. Lethal symptom ofinfected by nematode strain of N-Yz1.

A，B，C－分離線蟲N-Yz1雄蟲及其頭部、尾部；D，E－線蟲雌蟲及其頭部；F，G－侵染期線蟲及其頭部。

Fig. 3. Morphological features of entomopathogenic nematodes N-Yz1 of male, female, and infective juvenile.

表1 分離昆蟲病原線蟲N-Yz1與斯氏線蟲模式株(S. carpocapsae)主要形態特征比較

*小卷蛾斯氏線蟲()特征參數參考斯氏線蟲多岐分類表[12]。L－體長；W－體寬；T－尾長；EP－頭至排泄孔距離；ES－頭至咽距離；SL－交合刺長。

* Parameters ofrefer to taxonomic classification of[12]. L, Body length; W, Body width; T, Tail length; EP, Distance from anterior end to excretory pore; ES, Distance from anterior end to end of pharynx; SL, Spicule length.

圖4 基于斯氏線蟲rDNA-ITS序列的分離線蟲N-Yz1的系統發育樹

Fig. 4. Phylogenetic tree of isolated nematode N-Yz1 based onrDNA-ITS sequence of

2.3 二化螟感染病原線蟲N-Yz1的死亡動態

病原線蟲N-Yz1對不同齡期二化螟幼蟲都有較高感染致死作用，死亡蟲體內后期生成大量侵染期線蟲。二化螟幼蟲感染線蟲死亡動態隨齡期變化而呈顯著差異(χ2=76.94，=0.0001)，表現為低齡(2～3齡)致死速度快、死亡率高，高齡幼蟲(4～6齡)致死速度較慢(圖5)。40 IJs/頭線蟲劑量處理二化螟，2～3齡幼蟲感染24 h后開始死亡，36 h進入死亡高峰，感染死亡率分別為76.67%和53.33%，48 h后死亡率達100%。4～5齡幼蟲感染24 h后也有死亡個體，但死亡高峰發生在48 h，感染死亡率分別為88.33%和83.33%。6齡幼蟲感染36 h后開始出現死亡，死亡周期延長至72 h，但感染致死率仍高達93.33%。

2.4 病原線蟲N-Yz1不同劑量對二化螟幼蟲的感染作用

病原線蟲N-Yz1不同劑量對二化螟4齡幼蟲的感染致死率呈顯著差異(4,10=103.6，=0.0001)。線蟲劑量與二化螟死亡率呈顯著正相關(=0.68，=0.0001)，隨劑量的增加，害蟲死亡率迅速提高。低劑量(10 IJs/頭)造成的死亡率較低，接種48 h后4齡二化螟死亡率僅為10%。而線蟲量提高到20 IJs/頭時，二化螟感染死亡率提高到76.67%，30 IJs/頭達90%以上，劑量提高到50 IJs/頭時，二化螟死亡率達100%(圖6)。

2.5 昆蟲病原線蟲N-Yz1對二化螟的搜索能力

試驗結果表明，病原線蟲N-Yz1對二化螟幼蟲具有明顯搜索能力，在距離寄主害蟲0～30 cm的范圍內，通過遷移擴散，感染二化螟并導致其死亡。不同距離影響線蟲的搜索效率，表現為隨搜索距離的增加，感染率下降，死亡周期延遲。病原線蟲距離二化螟5～10 cm內能夠快速搜尋到寄生，24 h即有二化螟感染致死，48 h感染致死率達60%～80%。搜索距離增加到20～30 cm，病原線蟲的搜尋能力明顯下降，48 h感染死亡率僅6.67%和3.33%，72 h距離30 cm的處理二化螟感染線蟲死亡率僅6.67%(圖7)。

圖5 不同齡期二化螟感染N-Yz1的死亡動態

Fig. 5. Mortality dynamic of different instars larvae ofinfected by N-Yz1.

圖6 N-Yz1不同劑量對4齡二化螟的感染致死作用

Fig. 6. Lethal effect of different dosages of N-Yz1 to 4th instar larvae of

圖7 N-Yz1不同搜索距離對4齡二化螟的感染致死作用

Fig. 7. Lethal effect of different foraging distance for N-Yz1 to 4th instar larvae of

3 討論

昆蟲病原線蟲是一類重要的天敵生物，對害蟲種群增長起著自然調節的作用，具有宿主范圍廣、安全無污染、生物相容性良好等優點，符合綠色、可持續性農業發展方向，在生物防治中的作用越來越受到人們的重視[14, 15]。本研究根據二化螟鉆蛀危害行為和棲居特點，自鉆蛀稻茬秸稈內越冬的二化螟自然罹死蟲體中分離獲得了感染二化螟的昆蟲病原線蟲N-Yz1，形態學、分子生物學鑒定為斯氏線蟲，與具有高度同源性。昆蟲病原線蟲在自然界廣泛存在，其分布范圍與寄主的棲息生境相關[16]，從土壤中分離是篩查昆蟲病原線蟲的重要途經?；诟拭C省昆蟲病原線蟲區系調查研究分離得到51個昆蟲病原線蟲種群，分屬于斯氏線蟲屬和異小桿線蟲屬()，其分布與土壤和植被類型關系密切，沙壤土和壤土中昆蟲病原線蟲檢出率分別高達12.2%和8.8%[17]。水稻主要害蟲病原物調查表明，褐飛虱()群體中索科線蟲自然感染率達50%～70%，大螟()和三化螟()也發現有線蟲的寄生[18]，說明昆蟲病原線蟲具有廣泛的寄主范圍和環境適應性。同時，昆蟲病原線蟲不同種類或品系具有不同的生物學特性和寄主?；訹19]，針對感染寄主蟲體選擇性分離篩選是獲取昆蟲病原線蟲生防資源的有效方法。

昆蟲病原線蟲隸屬于線蟲門小桿目，主要包括斯氏線蟲屬和異小桿線蟲屬。斯氏線蟲腸道攜帶共生菌，能引起寄主快速死亡，而且具有搜索宿主靶標的功能，成為研究應用最多的昆蟲病原線蟲類群[20]。目前已鑒定了小卷蛾斯氏線蟲()、海濱斯氏線蟲()等60多個種，寄主范圍包括鱗翅目、鞘翅目、同翅目等多種農林害蟲[21]。本研究分離獲得的斯氏線蟲N-Yz1對二化螟具有顯著的感染致死活性，30 IJs/頭劑量下4齡二化螟致死率達93%，50 IJs/頭達100%，對低齡和高齡二化螟幼蟲都表現出較高的感染致死作用，為田間應用提供了較為寬泛的防治適期選擇。同時，分離病原線蟲N-Yz1具有主動搜索能力，通過遷移擴散，感染30 cm以內的二化螟，表現出防治水稻鉆蛀害蟲二化螟的潛在價值。

基于昆蟲病原線蟲生態學和行為學的研究表明，昆蟲病原線蟲在環境中的存活和防治效果主要取決于土壤的溫度、濕度、土壤類型和天敵等環境與生態因子[22]，線蟲的種類或品系也直接影響對靶標害蟲的侵染力[23, 24]。二化螟是危害水稻的重要鉆蛀害蟲，具有寄主專化性、分布地域性的特征，因此應針對性開展昆蟲病原線蟲高侵染活性和搜尋功能品系的篩選和馴化，同時根據稻田生態環境及二化螟危害特點，研究制定適合昆蟲病原線蟲棲居和侵染的應用技術，以提高應用病原線蟲防治水稻二化螟等鉆蛀害蟲的應用效果。

4 結論

野外越冬二化螟種群中自然罹死蟲體內分離獲得感染二化螟的昆蟲病原線蟲N-Yz1，形態學觀察結合rDNA-ITS序列分析，鑒定分離昆蟲病原線蟲隸屬于斯氏線蟲屬，與已鑒定種小卷蛾斯氏線蟲同源性達99.87%。昆蟲病原線蟲N-Yz1對不同齡期二化螟幼蟲都有較高感染致死作用，30 IJs/頭劑量下4齡二化螟幼蟲感染致死率達93%。同時，N-Yz1具有主動搜索能力，可通過遷移擴散，感染30 cm以內的二化螟，表現出防治水稻鉆蛀害蟲二化螟的潛在應用價值。

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Isolation and Identification of Entomopathogenic Nematode N-Yz1 fromand Its Infection Characteristics

LIU Qin1, 2, XIA Yang2, HAN Guangjie2, LI Chuanming2, LU Yurong2, HUANG Lixin2, QI Jianhang1,XU Jian2, *

(Yangzhou Luyuan Bio-chemical Ltd. Co., Yangzhou 225008; China; Jiangsu Lixiahe District Institute of Agricultural Sciences/National Experimental Station of Yangzhou for Agricultural Microbiology, Yangzhou 225007, China; *)

【Objective】The rice stem borer [(walker)] is an important pest to rice that threatens rice growth. The fact that it bores into rice stems adds to the difficulties of control. This study focuses on the isolation of the entomopathogenic nematodes ofand analysis of the infection of the pest to provide new strategies and methods for the control of boring pests on rice. 【Method】We obtained and identified entomopathogenic nematodes from the overwintering generationin the rice stubbles through tissue isolation. Then, the lethal effect and infecting characters of the isolated entomopathogenic nematodes against thewere analyzed by inoculation into the larvae of. 【Result】The wild-infected entomopathogenic nematode named N-Yz1 was isolated from dead larvae of, then the isolated nematodes were inoculated into the 4th instar larvae of, leading to their infection and death, with mass nematodes emerged in the dead larvae. Based on the morphological features and analysis of the sequences of rDNA ITS, the strain of N-Yz1 was identified in the genus of, which shared the homology of 99.89% with that of the species of. The nematode N-Yz1 had highly infectious and lethal effects on different instar larvae of. Inoculation with a nematode dose of 40 IJs per larva resulted in rapid lethality and high mortality of the juvenile larvae (the second and third instar), with infected lethal individuals appearing within 24 h after inoculation and the death of all larvae 48 h later. For the elder larvae (the fourth to sixth instar), the killing speed was relatively slow, with peak mortality occurring 48 h after nematode inoculation. We also found that positive correlation between inoculum dosage of N-Yz1 and the mortality rate of. The mortality rates of the 4th instarwere more than 90% when the inoculation dose exceeded 30 IJs per larva. The results also showed that N-Yz1 could foragelarvae within the distance of 30 cm, and kill the larvae through immigrating and diffusion. 【Conclusion】The isolated entomopathogenic nematode N-Yz1, a strain of, has strong infective and lethal effect, and potential applications for the control of the rice stem borer,.

;; isolation and identification; infecting character

10.16819/j.1001-7216.2022.211202

2021-12-02；

2022-04-02。

江蘇省國際合作項目(BZ2020039)；江蘇省農業科技自主創新資金資助項目[CX(20)1004]；農業基礎性長期性觀測監測項目(NAES069AM04，NAES-EE-041)。