Diversin對胃腺癌細胞惡性轉化、侵襲和遷移能力的調控作用

李楠洋 吳非 韓斌 王翠芳 欒嵐

(沈陽醫學院 1附屬中心醫院病理科，遼寧 沈陽 110024；2基礎醫學院病理學教研室；3中國醫科大學附屬盛京醫院泌尿外科)

胃癌是當今發病率較高的消化系統惡性腫瘤。本課題組長期致力于錨蛋白重復序列6(Diversin)在腫瘤的發生發展侵襲轉移機制的相關研究，前期結果顯示Diversin在非小細胞肺癌〔1〕、三陰乳腺癌〔2〕、神經膠質瘤〔3〕中高表達。免疫組化結果顯示，Diversin在胃腺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織,Diversin的表達主要定位于腫瘤細胞的胞質與胞膜處〔4〕，且Diversin與胃癌患者的腫瘤直徑、TNM分期、有無淋巴結轉移相關〔5〕。本課題組利用基因芯片技術分析下調腫瘤細胞中Diversin與對照組中信號通路及下游靶分子的變化。基因芯片結果顯示，Diversin可顯著激活腫瘤細胞的G1/S期檢測點，這一結果提示Diversin很可能在胃癌細胞的細胞周期調控機制中發揮重要作用。同時基因芯片結果顯示Diversin可以顯著激活Wnt/c-Jun氨基末端激酶(JNK)和ERK-5信號通路，而研究表明ERK5可以顯著上調肝癌〔6，7〕、卵巢癌〔8，9〕、前列腺癌〔10，11〕及肺癌〔12〕的淋巴結黏附功能〔13，14〕，Wnt/JNK信號通路的激活廣泛存在于非小細胞肺癌〔14〕、口腔鱗癌〔15〕、三陰乳腺癌〔16〕及食管癌〔17〕中，并且對腫瘤的發生發展和預后發揮重要的調控作用。綜上，Diversin很可能是調控胃癌淋巴結黏附甚至是調控淋巴道轉移的關鍵分子之一。本實驗旨在探討Diversin對胃腺癌細胞惡性轉化與侵襲轉移的調控作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料 胃未分化癌細胞系HGC27和胃中分化癌細胞系MNK45購買于長沙優生物有限公司，RPMI1640培養基和胎牛血清購買于BI公司。 Diversin過表達載體GV326質粒(Div-GV326)與Diversin shRNA載體GV248質粒(Div sh-GV248)由上海吉瑪公司合成。Transwell小室購買于millipore公司。結晶紫染液購買于碧云天生物技術有限公司。Diversin抗體購買于Santa Cruz公司，β-actin抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠和山羊抗兔購買于碧云天生物技術有限公司。

1.2細胞培養 人胃腺癌細胞HGC27和MNK45細胞系培養于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養液內，同時將細胞置于濃度為5%CO2的細胞培養箱內培養。細胞復蘇：從液氮中取出HGC27和MNK45細胞，迅速置于37℃水浴中，使其在1 min內完全融化，將細胞懸液加入15 ml離心管中并加入高壓滅菌過的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，1 000 r/min，5 min離心后棄上清，加入含10%FBS的RPMI1640培養液，輕柔吹打混勻，細胞懸液移至培養瓶中，充分混勻后，將培養瓶轉移至細胞培養箱中培養，培養條件為37℃，5%CO2，培養12 h后待細胞貼壁生長后，棄去培養瓶中的培養基，加入高壓滅菌的PBS洗滌細胞，加入含10%FBS的RPMI1640培養基，將培養瓶置于恒溫培養箱中培養。細胞傳代：待細胞接合度達到80%～90%時，吸去舊培養液，培養瓶加入高壓滅菌過的PBS洗滌細胞，加入胰酶消化細胞1～2 min后加入含10%FBS的RPMI1640培養液終止消化，吹打混勻細胞后，將細胞分裝于新的細胞培養瓶中，每瓶加入5 ml含10%FBS的RPMI1640培養基，置于恒溫培養箱中培養細胞，培養條件為37℃，5%CO2。

1.3質粒轉染 將處于對數生長期的HGC27細胞和MNK45細胞用胰酶消化，用加入含有10% FBS的RPMI1640培養基終止消化，然后輕柔吹打細胞成單細胞懸液。將細胞懸液均勻接種于6孔板中，每孔約10 000個細胞，隨后將6孔板置于37℃，5%CO2培養箱中孵育，待細胞接合度達到70%時進行轉染。為了上調Diversin的表達水平，分別利用轉染Diversin過表達質粒Diversin-GV326到HGC27和MNK45細胞分別作為HGC27上調組和MNK45上調組，同時轉染GV326質粒到HGC27和MNK45細胞中分別作為HGC27上調對照組和MNK45上調對照組。為了下調Diversin的表達水平，分別利用轉染Diversin sh-GV248質粒到HGC27和MNK45細胞分別作為HGC27下調組和MNK45下調組，同時轉染GV326質粒到HGC27和MNK45細胞中分別作為HGC27下調對照組和MNK45下調對照組，轉染Diversin-GV326和Diversin sh-GV248質粒的工作濃度分別為250 ng/ml和50 ng/ml。采用攜帶新霉素(G418)抗性標簽的GV326過表達質粒和攜帶嘌呤霉素的GV248質粒進行轉染。篩選合適的G418和嘌呤霉素濃度用以維持穩定的陽性轉染細胞。利用轉染GV326質粒構建Diversin過表達載體和GV248質粒構建Diversin shRNA的RNA干擾質粒分別上調和下調HGC27和MNK45細胞中Diversin的表達水平，并且用含G418濃度為20 μg/ml和40 μg/ml的RPMI1640培養基分別培養HGC27細胞和MNK45細胞，含嘌呤霉素濃度為2 μg/ml和3 μg/ml的RPMI1640培養基分別培養HGC27細胞和MNK45細胞。

1.4蛋白印跡 將轉染72 h的細胞從培養箱中取出，棄去培養基，高壓滅菌的PBS洗滌細胞，加入胰酶消化細胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培養基終止消化，將細胞輕柔吹打成細胞懸液；加入細胞裂解液〔0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)pH7.5,20 μmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),0.1%免疫染色通透液(Triton X)-100〕500 μl吹打細胞，冰上靜置4 h，12 000 r/min，低溫離心20 min，取上清進行蛋白定量。

配制濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%的聚丙烯酰胺凝膠，每孔加入100 μg用溴酚藍緩沖液稀釋的樣品，濃縮膠階段采用70 V恒壓電泳，待溴酚藍指示劑達到分離膠后將電壓調至100 V恒壓電泳，待溴酚藍指示劑達到局凝膠下緣0.5 cm時，終止電泳；將凝膠取出，將凝膠中的樣品轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；用5%脫脂奶粉/TTBS 于室溫封閉2 h,TTBS洗滌3次每次5 min;利用TTBS稀釋一抗Diversin抗體〔Santa Cruz兔抗人 免疫球蛋白(Ig)G〕和β-actin(碧云天 小鼠抗人)稀釋倍數分別為1∶200和1∶1 000，4℃孵育過夜,TTBS 洗3次每次15 min，二抗(小鼠 IgG Biotin,1∶2 000) 37℃1 h,TTBS 洗滌3次，每次15 min;將 PVDF 膜放入凝膠成像自動檢測儀的暗室中。滴加電化學發光(ECL)工作液到膜上，進行檢測，使用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白和內參β-actin 的光密度比值，作為目標蛋白的表達相對量。

1.5克隆形成實驗 將轉染72 h的細胞從培養箱中取出，棄去培養基，高壓滅菌的PBS洗滌細胞，加入胰酶消化細胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培養基終止消化，將細胞輕柔吹打成細胞懸液；將各組細胞分別接種于6孔板內，每孔接種細胞數為5 000個，加入1 ml含10%FBS的RPMI1640培養基后將6孔板置于37℃恒溫培養基中培養，每24 h更換一次含10%FBS的RPMI1640培養基，HGC27細胞和MNK45細胞系分別培養48 h和72 h后進行觀察；將細胞從培養箱中取出，棄去培養基，PBS洗滌3次。將6孔板倒扣在干凈的吸水紙上空干殘留液體。加入37%甲醛溶液，室溫固定10 min，吸去甲醛溶液并空干殘留液體，加入結晶紫染液0.5 ml室溫染色10 min。染色后吸去結晶紫染液，PBS洗滌3次，每次10 min，將6孔板倒扣于干凈的吸水紙上空干殘留液體，將6孔板置于燈箱上觀察，計數各組染色陽性的單克隆個數比較各組差異，上述實驗重復3次。

1.6Transwell 將轉染72 h的細胞從培養箱中取出，棄去培養基，高壓滅菌的PBS洗滌細胞，加入胰酶消化細胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培養基終止消化，將細胞輕柔吹打成細胞懸液。將Transwell小室(含matrigal)置于24孔板上，用RPMI1640培養基將各組細胞吹打成單細胞懸液，接種于上室，每個小室接種細胞數為500個；下室加入500 μl 含10%FBS的RPMI1640培養基，將各組細胞所在的24孔板至于37℃ 5%CO2培養箱中分別孵育HGC27細胞和MNK45細胞12 h和24 h。孵育結束之后將小室取出，用一次性醫用棉簽拭去上室中的細胞，然后將小室置于干凈的吸水紙上空吸去殘余液體后置于37%甲醛溶液中固定5 min，然后立即將小室取出置于結晶紫染液中染色10 min，染色完畢后將小室置于PBS中漂洗洗去多余的結晶紫溶液，將小室置于新的24孔板中，在放大倍數為20倍的光鏡下，隨機選取5個視野，通過計數成功到達小室下室的細胞數的不同反映各組細胞侵襲能力的不同，結果取平均值，實驗重復3次。

1.7劃痕試驗 將轉染72 h的細胞從培養箱中取出，棄去培養基，高壓滅菌的PBS洗滌細胞，加入胰酶消化細胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培養基終止消化，將細胞輕柔吹打成細胞懸液。將單細胞懸液接種于6孔板中每孔不少于2×106個細胞，37℃ 5%CO2培養箱中培養。待細胞重合度達到95%以上后用記號筆在6孔板底部劃線標記，然后用20 μl Tip頭在垂直于記號筆標記方向將6孔板中細胞劃痕，然后顯微鏡下拍照記作0 h，將HGC27和MNK45各組細胞所在的6孔板置于37℃ 5%CO2培養箱中，于6 h后取出MNK45上調組與上調對照組，12 h后取MNK45下調組與下調對照組，8 h后取出各組HGC27細胞。在放大倍數為20倍的鏡下，觀察各組細胞向劃痕中遷移的趨勢，并且記錄劃痕兩側細胞的距離，上述實驗重復3次。

1.8統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1上調和下調HGC27和MNK45細胞中Diversin表達水平 HGC27上調組和MNK45上調組中Diversin表達水平分別顯著高于HGC27上調對照組和MNK45上調對照組(P<0.05)，而HGC27下調組和MNK45下調組中Diversin的表達水平分別顯著低于HGC27下調對照組和MNK45下調對照組(P<0.05),上述處理方式可較長時間維持相應細胞中Diversin的表達水平。見圖1和表1。

2.2Diversin促進胃癌細胞惡性轉化 HGC27上調組和MNK45上調組形成的克隆數分別顯著高于HGC27上調對照組和MNK45上調對照組(P<0.05)，而HGC27下調組和MNK45下調組形成的克隆數分別顯著低于HGC27下調對照組和MNK45下調對照組(P<0.05)。見圖2和表1。

2.3Diversin上調胃癌細胞侵襲能力 HGC27上調組和MNK45上調組成功到達Transwell小室下室的細胞數分別高于HGC27上調對照組和MNK45上調對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，而HGC27下調對照組和MNK45下調對照組成功到達Transwell小室下室的細胞數分別低于HGC27下調組和MNK45下調組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖3和表1。

2.4Diversin上調胃癌細胞的遷移能力 HGC27上調組和MNK45上調組劃痕區域中的細胞數分別顯著高于HGC27上調對照組和MNK45上調對照組(P<0.05)，而HGC27下調組和MNK45下調組劃痕區域中的細胞數分別顯著低于HGC27下調對照組和MNK45下調對照組(P<0.05)。見圖4和表1。

表1 各組Diversin表達蛋白印跡、克隆形成試驗、Transwell和劃痕試驗結果

3 討 論

克隆形成實驗顯示Diversin可能是促進胃癌細胞惡性轉化的因素，為了證實Diversin參與調控胃癌細胞惡性轉化的作用，本課題組前期實驗中，基因芯片結果顯示Diversin的表達水平可能與腫瘤細胞中Wnt/JNK信號通路和ERK信號通路的活性相關，研究表明在胃的惡性潰瘍組織中，潰瘍灶中Wnt/JNK信號通路靶分子的表達水平顯著高于正常胃黏膜組織〔18，19〕，其中過表達核轉錄因子(NF)-κB的胃未分化癌HGC27細胞中Wnt/JNK信號通路的活性顯著升高〔20〕，而經典Wnt/β-catenin信號通路下游靶分子的表達水平并未顯著升高〔21〕，以上研究結果提示，在惡性程度較高的胃癌細胞中Wnt/JNK信號通路可能發揮重要的調控細胞惡性轉化的作用。

本研究中Transwell和劃痕試驗結果提示Diversin可能參與調控胃癌細胞的侵襲轉移能力。腫瘤侵襲轉移的初始過程包括黏附和浸潤兩個過程。為了證實Diversin對胃癌細胞惡性轉化的調控作用，本課題組后續實驗計劃利用Diversin穩定上調和穩定下調的胃癌細胞系開展體外淋巴結黏附試驗，并從mRNA和蛋白水平分析黏附相關分子黏著斑激酶(FAK)，基質金屬蛋白酶(MMPs)，CD22等基因的表達情況，并且利用明膠酶譜分析Diversin對胃癌細胞中MMP活性的調控作用對上述結果進行完善。為了更直觀地檢測Diversin調控胃癌細胞惡性轉化與侵襲轉移的作用及其機制，本課題組后續將對Diversin穩定上調和穩定下調的胃癌細胞開展裸鼠荷瘤實驗，進一步明確Diversin對胃癌細胞侵襲轉移和惡性轉化過程的調控作用。同時有研究表明腫瘤的發生發展與免疫細胞的功能異常有著密切關系，巨噬細胞的M2型極化與胃癌、結腸癌的發生發展、血管新生、免疫逃逸等生命活動密切相關〔21，22〕，本課題組后續實驗擬將Diversin穩定上調和穩定下調的胃癌細胞與巨噬細胞或淋巴細胞進行三維共培養并開展動物實驗，完善Diversin調控胃癌細胞發生發展過程中信號網絡的研究。