NASH患者外周血單個核細胞TXNIP/NLRP3水平變化及其臨床意義探討*

張 斌，王依屹，石 磊

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)又被稱為代謝性脂肪性肝炎，其為肝組織病理學變化與酒精性肝炎相似而無過量飲酒史的一種臨床綜合征，好發于中年，尤其是超重肥胖人群，以肝細胞大泡性脂肪變伴肝細胞損傷和炎癥等為主要特征，嚴重者將進展為肝纖維化，甚至肝硬化，嚴重危害患者身體健康[1，2]。及時對NASH患者疾病轉歸進行預測是改善其治療結局和預后的關鍵。目前，臨床對NASH病機尚未完全明確，臨床尚缺乏特異性的診斷指標[3]。有研究指出，炎癥反應和炎性損傷是誘發NASH 發生發展的最主要的原因[4，5]。硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)是體內重要的抗氧化蛋白，其能通過抑制TRX介導氧化應激反應，并誘導細胞凋亡，與NASH發病可能相關[6]。NOD樣受體家族含pyrin結構域蛋白3(NLRP3)參與組成的炎癥小體是細胞質中的一種大分子復合蛋白，實驗研究發現NLRP3基因敲除對改善NASH小鼠肝損傷和脂代謝有明確的保護作用[7]。本研究探討了NASH患者外周血TXNIP/NLRP3水平變化及其臨床意義，旨在為有效診治NASH患者提供更多的參考依據。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2019年1月～2021年1月我院收治的NASH患者150例，男85例，女65例；年齡為33～65歲，平均年齡為(44.21±7.32)歲。符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[8]關于NASH的診斷標準，入院前未接受過任何藥物治療。排除標準：病毒性肝炎或藥物性肝損傷；應用過免疫抑制劑或抗生素類藥物；凝血功能障礙；嚴重的感染性或血液性疾病；嚴重的精神障礙；妊娠或哺乳期婦女。另選擇同期在本院體檢的單純性脂肪肝患者45例，男29例，女16例；年齡為35～68歲，平均年齡為(45.04±6.98)歲。兩組年齡和性別比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。受試者簽署書面知情同意書，本研究經我院醫學倫理委員會審核、通過。

1.2 肝穿刺活檢 常規進行肝穿刺活檢。根據肝組織病理學檢查結果[9]將NASH患者分為輕度(不合并或僅有輕度的纖維化)、中度(合并顯著的肝纖維化或間隔纖維化)和重度(合并肝硬化)。隨訪12個月，再次行肝穿刺活檢，判斷疾病轉歸(進展，為輕度者進展為中度或重度，或中度者進展為重度，或肝硬化進展，和無進展，各病變程度維持原狀或改善)。

1.3 外周血單個核細胞(PBMC)TXNIP/NLRP3水平檢測 取干凈試管，加Ficoll分離液6 mL，加肝素抗凝。沿管壁用滴管將混懸液緩慢滴加至分層液上層，377 g離心15 min，采集上、中層界面白色云霧層細胞，移至含5 mL細胞洗滌液試管中，混勻后107 g離心20 min，反復洗滌沉淀，得到PBMCs，4℃冷藏備用。按照TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA，在紫外分光光度計上檢測并記錄總RNA濃度和純度。將總RNA逆轉錄為cDNA。取cDNA，建立20μL反應體系，根據qRT-PCR試劑盒說明書進行qRT-PCR。以2-△△Ct表示目的基因與對照基因表達的倍數。引物序列：TXNIP，上游TGGCTGTAACATTCGGAGATTGTGG，下游GCTTCTGGTTGCTGCTGCTGCGGAC；NLRP3，上游AATTGGCAGCAGATCAGGTCTAAGC，下游CATGTCATCTAGCAGAGGAGTGGTTG；β-action參照物，上游CATGTACGTTGCTATCCAGGC，下游CTCCTTAATGTCACGCACGAT。

1.4 血生化檢測 常規進行。

2 結果

2.1 兩組血生化指標比較 NASH組血清ALT和AST水平顯著高于單純性脂肪肝組(P<0.05，表1)。

表1 兩組血生化指標比較

2.2 兩組PBMCs TXNIP/NLRP3水平比較 NASH組PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值顯著高于單純性脂肪肝組(P<0.05，表2)。

表2 兩組比較

2.3 不同病情NASH患者血生化指標和PBMCs TXNIP/NLRP3水平比較 在150例NASH患者中，經組織病理學檢查，診斷輕度49例，中度68例和重度33例；重度組血清ALT、AST及PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 Mrna和TXNIP/NLRP3比值顯著高于輕度組或中度組，而中度組也顯著高于輕度組(P<0.05，表3)。

表3 不同病情NASH患者血生化和PBMCs TXNIP/NLRP3水平比較

2.4 不同疾病轉歸NASH患者PBMCs TXNIP/NLRP3水平比較 經二次肝穿隨訪，在150例NASH患者中，發現疾病進展31例，無進展119例；進展組PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值顯著高于無進展組(P<0.05，表4)。

表4 不同疾病轉歸NASH患者PBMCs TXNIP/NLRP3水平比較

3 討論

NASH是一種多系統疾病，不僅影響患者肝臟組織結構和功能，且會增加心腦血管疾病、慢性腎病和腫瘤的發病風險。NASH的流行給人們生命健康及社會經濟生活帶來了沉重的負擔[10]。目前，對NASH病機尚未完全明確，主要涉及“脂質代謝失衡”、“胰島素抵抗”、“炎癥反應”等機制。研究指出，NASH發病與炎癥反應和胰島素抵抗有關[11，12]。有動物實驗研究表明NASH病情嚴重程度與脂質代謝失衡相關[13]。近期有報道指出“炎癥小體激活”可能是初始代謝應激和肝纖維化甚至是肝細胞死亡的重要原因。TXNIP/NLRP3水平是反映機體炎癥小體激活的重要標志物[14]，而本研究通過檢測NASH患者外周血單個核細胞TXNIP/NLRP3水平變化，分析了它們與疾病病情程度和是否進展的關系，有望為NASH病情評估和疾病轉歸的預測提供更多的參考依據。

本研究結果顯示，NASH組肝功能指標及PBMC TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值顯著高于單純性脂肪肝患者，提示NASH患者存在明顯的肝功能損害，外周血細胞TXNIP/NLRP3水平呈明顯的高水平。NASH患者因脂肪攝入過多和脂肪代謝的異常或運動減少，導致脂肪沉積于肝臟，引發對肝細胞壓迫或嚴重脂肪變損傷。因此，NASH患者存在明顯的肝功能損害[15]。目前，對NASH病機的研究尚未完全明確，其中炎癥小體激活被視為是NASH發病的一個重要機制。動物實驗研究證實NLRP3炎性小體功能喪失的小鼠經高脂飲食誘導后并不會形成NASH[16]。另有報道指出，TXNIP分子通過增加TXNIP mRNA表達而加重機體炎性反應[17]，這也是NASH患者外周血單個核細胞TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值較單純性脂肪肝群體明顯增高的主要原因。本研究結果還顯示輕度、中度、重度NASH患者血清ALT和AST水平，PBMC TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值依次明顯增高，提示隨著NASH患者病情加重肝功能損害越嚴重，同時患者PBMC TXNIP/NLRP3水平也越高。NASH患者在肝細胞損傷及膽汁淤積等多種因素作用下，出現肝實質細胞脂肪變、細胞壞死和炎癥反應，使得在膠原合成增加的同時其分解減少，同時激活人體免疫系統，引起T淋巴細胞亞群的改變，導致機體炎癥因子的分泌紊亂，且這種紊亂隨著患者病情程度加重而更為明顯[18]。NASH患者存在持續的肝臟創傷和修復過程，易引起肝臟代謝紊亂，并且易致血脂蓄積，導致肝細胞出現不同程度的脂肪變性、細胞壞死，使得肝細胞外基質過度沉積。同時NASH發作后肝細胞脂肪變性加重，從而激發機體的炎癥反應[19]，而隨著患者病情程度的加重，表現為更為明顯的肝功能損害和外周血單個核細胞TXNIP/NLRP3水平的增高。

如果NASH患者診治不及時易進展為肝纖維化或肝硬化。因此，NASH患者疾病轉歸是目前臨床重點關注的項目。盡管上述研究均明確了NASH患者病情程度與血液指標的關聯。TXNIP/NLRP3炎癥小體與多種疾病的發生密切相關。早前主要報道在視網膜神經退行性疾病、急性肝損傷、帕金森病等疾病患者有過研究報道，近期有報道指出TXNIP/NLRP3炎癥小體參與慢性阻塞性肺病患者機體炎癥反應過程[20]。本研究結果顯示進展期NASH患者PBMC TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值較無進展組明顯升高，提示NASH患者外周血單個核細胞TXNIP/NLRP3水平與肝功能和病情嚴重程度密切相關。外周血單個核細胞TXNIP/NLRP3水平可能通過加重機體炎癥反應而促進NASH患者病情進展。積極監測患者TXNIP/NLRP3水平對NASH病情評估有一定的指導意義。

綜上所述，NASH患者外周血單個核細胞TXNIP/NLRP3水平與疾病嚴重程度和轉歸密切相關。積極監測患者PBMC TXNIP/NLRP3水平對病情評估和疾病轉歸預測都有重要的指導意義。但本研究同時存在樣本量小和隨訪時間短等不足，數據的同質性和異質性尚需進一步研究證實，未來還需延長隨訪時間和觀察。