癌組織M6A甲基轉移酶樣蛋白3水平對手術切除后接受索拉非尼治療的肝細胞癌患者預后的影響*

高正興，李廣欣，宋春青

肝細胞癌(HCC)為肝臟最常見的原發性惡性腫瘤。歐洲肝臟病研究學會認為，目前肝癌已成為全球男性第五大常見的惡性腫瘤之一，在女性則排名第八位，占全球癌癥總數的5.4%左右，每年約造成69.5萬人死亡[1]。術后給予索拉非尼治療HCC患者能有效抑制血管內皮生長因子受體和血小板衍生性生長因子受體，阻斷腫瘤新生血管的生成，抑制腫瘤細胞生長[2，3]。有關基因的水平及其功能發揮在腫瘤發生、發展、轉移過程中扮演重要角色。同時，它們也是早期診斷、靶向治療、預后評估腫瘤患者的研究熱點[4]。己發現上百種RNA修飾方式，其中N6-甲基嘌呤(M6A)是出現在腺嘌呤第六位N原子上的甲基化修飾方式，也是最常見的基因轉錄后RNA修飾方式，約占RNA甲基化修飾的80%[5]。甲基轉移酶樣蛋白3(METTL3)為甲基轉移酶復合物主要的催化成分，一方面其是催化細胞RNA M6A修飾形成的主要酶，經M6A修飾途徑調節基因水平；另一方面，METTL3具備促進mRNA翻譯的能力[6，7]。肺癌[8]、白血病[9]、前列腺癌[10]等腫瘤組織METTL3呈現異常高水平，可能發揮了促癌基因的作用。本研究檢測了HCC組織METTL3水平，并分析了其對索拉非尼治療效果的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年8月～2019年8月我院診治的HCC患者62例，男43例，女19例；年齡為41～78歲，平均年齡為(60.9±10.1)歲。診斷符合《原發性肝癌診療規范(2011年版)》[11]的標準，其中乙型肝炎55例，丙型肝炎2例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ期28例；Child-Pugh分級：A級33例，B級29例；肝外轉移：無46例，有16例。納入患者預計生存期≥12周。排除標準：合并其他惡性腫瘤、合并血液系統疾病、合并人類免疫缺陷病毒感染、存在惡液質或多器官功能衰竭。患者及其家屬簽署知情同意書，本研究經我院醫學倫理委員會審核、通過。

1.2 治療方法 肝切除術：所有患者均接受術中超聲檢查，劃定手術切除范圍，盡可能保留足夠的剩余肝臟。對于合并門靜脈癌栓者，在切除腫瘤的同時依據癌栓位置進行門靜脈切開取栓或門靜脈殘端取栓；對于合并膽管癌栓者，行腫瘤切除和膽總管切開取栓術；對于存在淋巴結轉移者行淋巴結清掃。術后，給予索拉非尼400 mg口服，2次/d，連續服藥。在服藥期間，根據患者出現的不良反應情況，及時調整藥物劑量。對于出現Ⅱ級以下不良反應者，給予對癥治療；對于出現Ⅱ級以上不良反應者，減低藥物劑量為400 mg，1次/d；對于出現Ⅲ級或以上不良反應時，予以停藥，待毒性反應緩解或降至Ⅱ級以下后，再逐步恢復至原劑量。

1.3 組織METTL3 mRNA水平檢測 采用qRT-PCR法，用Trozol試劑提取癌組織和癌周組織總RNA。采用 Prime ScriptTMRT 反轉錄試劑盒(日本寶日醫生物科技公司)將總RNA反轉錄為cDNA，使用 SYBR. Premix Ex Taq qRT-PCR試劑盒(北京全式金生物科技公司)擴增cDNA，應用2-△△CT法計算METTL3 mRNA相對水平。METTL3 上游引物為 5′-CCCTATGGGACCCTGACAG-3′，下游引物為5′- CTGGTTGAAGCCTTGGGGAT-3′，內參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶 ( GAPDH) ，其上游引物為5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下 游 引 物 為 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.4 隨訪 采用門診復查或電話隨訪，隨訪時間為2年。調查并記錄患者生存情況。

2 結果

2.1 癌組織與癌旁組織METTL3 mRNA水平比較 62例癌組織METTL3 mRNA水平為(7.7±1.4)，顯著高于癌旁組織(5.3±1.1，P<0.05)。

2.2 不同臨床和病理學特征患者癌組織METTL3 mRNA水平比較 在腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ期和肝外轉移患者癌組織METTL3 mRNA水平顯著高于腫瘤直徑<5 cm、TNM分期Ⅰ/Ⅱ期和無肝外轉移患者(P<0.05，表1)。

表1 不同臨床和病理學特征患者癌組織METTL3 mRNA水平比較

2.3 肝細胞癌患者癌組織METTL3水平對患者預后的預測價值 在隨訪2年末，肝細胞癌患者生存27例，死亡35例；生存組癌組織METTL3水平為(7.0±1.0)，顯著低于死亡組[(8.2±1.1)，P<0.05]；應用METTL3水平預測患者預后的最佳截斷點為7.6，ROC曲線下面積(AUC)為0.712[95%CI：0.584～00.839]，其靈敏度、特異度和準確度分別為71.4%、66.7%和69.4%(圖1)。

圖1 應用癌組織METTL3 mRNA水平預測肝細胞癌患者預后的效能

2.4 癌組織METTL3高水平與低水平肝細胞癌患者Kaplan-Meier生存分析 隨訪2年，繪制2 a總體生存曲線，按照癌組織METTL3 mRNA水平評估最佳截斷點，結果將METTL3 mRNA水平<7.6者納入低水平組(n=28)，≥7.6者納入高水平組(n=34)。隨訪結果顯示，METTL3 mRNA低水平組2 a總體生存率為64.3%，顯著高于高水平組的26.5%(P<0.05)。

3 討論

肝細胞癌病死率居我國惡性腫瘤的前列，嚴重威脅人類生命健康。雖然現階段肝癌的檢測、診斷、治療水平不斷提高，但其治療效果仍不理想[12]。近年來研究結果表明[13]，腫瘤分子靶向治療具有良好的安全性和一定的有效性，尤其是針對多靶點Raf激酶抑制劑、表皮生長因子受體和血管內皮生長因子為靶點的藥物。索拉非尼作為一種小分子激酶抑制劑能有效阻斷腫瘤新生血管的生成，抑制腫瘤細胞增殖。

M6A為真核mRNA最常見的修飾方式，由甲基轉移酶復合體(METTL3、METTL14、WTAP)組成。去甲基轉移酶(FTO、ALKBH5)與結合蛋白(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2)協同調控其表達[14]。METTL3作為甲基轉移酶復合體成員之一，具有獨立的或與其它甲基轉移酶共同催化RNA的M6A修飾形成，發揮其生理功能。既往研究顯示[15]METTL3調控的腫瘤基因血管內皮生長因子和B淋巴細胞瘤-2也是與前列腺癌關系密切的癌基因，由此推測METTL3通過調控前列腺癌腫瘤基因影響前列腺癌細胞的生物學行為。METTL3在膠質母細胞瘤、乳腺癌的研究中也顯示METTL3表現出促癌作用[16]。在另一項研究中[17]，METTL3被認為是腎癌的抑癌基因，抑制腫瘤增殖、遷移。這些結果表明，METTL3可能在不同分化腫瘤中具有截然相反的作用，可能是由于腫瘤微環境的復雜性、腫瘤高度異質性所致，同時也與METLL3 參與腫瘤的作用密不可分。本研究分析了肝細胞癌組織METLL3水平，分析了其與肝細胞癌發生發展的關系。

本研究顯示肝細胞癌癌組織METTL3 mRNA水平顯著高于癌旁組織，上調的METTL3可使腫瘤相關癌基因蛋白mRNA m6A修飾豐度增加，從而使其蛋白水平增加，促進肝癌細胞的增殖，在腫瘤發生過程中發揮促癌基因作用。沉默METTL3可有效抑制肝癌細胞增殖、侵襲、克隆能力，增加腫瘤細胞凋亡。進一步分析METTL3 mRNA水平與肝細胞癌臨床和病理學特征的關系，結果顯示METTL3 mRNA水平與腫瘤直徑、TNM分期和肝外轉移均有一定的關系。METTL3 mRNA水平隨著腫瘤直徑增大、分期增高和肝外轉移呈升高態勢，提示METTL3參與肝細胞癌的進展。METTL3 參與調控mRNA m6A甲基化修飾，這種化學修飾是可逆的，在真核生物體內廣泛存在。由于該位點甲基化狀態呈實時動態變化，導致mRNA 生成、降解改變，進而影響相關基因的翻譯水平，一些重要促癌基因的翻譯也受影響[18]。近期也有一些研究發現[19]，METTL3同樣能夠以一種不依賴甲基轉移酶催化活性及m6A閱讀蛋白方式對調控促癌基因翻譯，受此方式調控的重要促癌基因包括表皮生長因子受體等。無論METTL3促進促癌基因翻譯是通過何種機制達到目的，其效果均是一樣的，即出現腫瘤細胞過度增殖，凋亡減少，這些變化不利于患者預后，導致腫瘤直徑快速增大，遠處轉移的風險增大。

臨床觀察到，一部分肝細胞癌患者應用索拉非尼治療后可有效抑制腫瘤進展，延長生存期，改善生活質量；也有部分患者治療效果不理想，甚至基本無效[20]。由于索拉菲尼價格昂貴，如何有效篩選合適的患者使其獲益增大是臨床工作者面臨的重大課題。為探討METTL3水平對索拉非尼治療的肝細胞癌患者預后的評估價值，本研究采用ROC曲線評估了癌組織METTL3水平的預測價值，發現有一定的臨床意義。進一步分析發現，癌組織METTL3高水平組與低水平組患者生存率存在顯著性差異，提示低水平組在索拉非尼治療后預后稍好。

綜上所述，肝細胞癌患者癌組織METTL3 mRNA呈現高水平，且其高水平狀態與腫瘤直徑、TNM分期和肝外轉移有關，預示患者預后不良。監測癌組織METTL3水平是否可作為術后接受索拉非尼治療的肝細胞癌患者的預后指標，值得進一步研究。