慢性乙型肝炎患者降鈣素基因相關肽和α-干擾素-λ4基因多態性對α-干擾素治療應答的影響*

齊孝安，盧金喜，袁 林

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是世界重要的公共衛生問題之一。慢性乙型肝炎(CHB)患者病情遷延反復，10%～30%患者將發展為肝硬化，部分患者進一步發展為肝細胞癌(HCC)[1]。HBV持續復制是CHB患者病情進展的主要原因，抑制病毒復制，降低體內病毒載量可達到改善患者預后的目的[2]。α-干擾素(α-IFN)是目前治療CHB患者的主要藥物之一，具有抗病毒和免疫調節作用，與核苷(酸)類似物相比，應用療程短，不易產生耐藥性，停藥后藥物持續應答時間長[3]。臨床上，應用α-干擾素治療CHB患者獲得應答后患者病情進展將得到有效的控制。然而，在治療過程中也有相當部分患者不能獲得應答，究其原因，除HBV本身生物學特征和宿主對HBV免疫狀態外，宿主相關基因單核苷酸多態性也是影響治療應答的重要因素[4]。降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)存在于感覺神經末梢，是一種神經肽，對機體多個臟器和系統功能均產生重要的調節作用，通過抑制肝星狀細胞活化發揮肝臟保護作用，促進肝再生[5]。α-干擾素-λ4(α-interferon-lambda4, IFNL4)能特異性地結合于異二聚體Ⅱ類細胞因子受體，具有免疫調節和抗病毒功效[6]。本研究探討了CHB患者CGRP和IFNL4基因多態性對α-IFN治療療效的影響，旨在為臨床治療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年9月～2021年2月我院診治的CHB患者92例，男51例，女41例；年齡為31～61歲，平均年齡為(39.4±8.9)歲；體質指數為18～27 kg/m2，平均為(23.3±1.3)kg/m2。符合《慢性乙型肝炎防治指南》[7]的診斷標準，血清HBsAg陽性超過6個月以上，血清HBV DNA大于或等于1×105copies /mL，血清天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)水平分別≥60 U/L，納入初治患者。排除標準：合并肝癌及其他嚴重器質性疾病、合并自身免疫性或血液系統疾病、合并獲得性免疫缺陷綜合征、對本研究治療藥物過敏、重疊其他肝炎病毒感染、入院治療前3個月內進行過其他免疫或抗病毒治療、妊娠或哺乳期婦女。入組對象簽署知情同意書，本研究獲得我院醫學倫理委員會批準。

1.2 治療方法 給予入組患者注射用重組α-干擾素α-2b(北京遠策藥業有限責任公司，國藥準字S20010074)3～5 MU皮下注射，1次/d，連續15 d 誘導治療后，隔日注射1次，持續治療1年。

1.3 療效判定 參照《慢性乙型肝炎防治指南》的療效判定標準[7]，應答為治療后血清HBV DNA檢測不到或下降值>2 lg copies/mL，肝功能指標正常。

1.4 血清CGRP和IFNL4基因多態性檢測 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)法檢測CGRP基因rs155209位點及IFNL4基因rs368234815和rs12979860位點多態性。抽取靜脈血4 mL，與EDTA混合。實驗貝克曼AMPurea XPDNA血液基因組提取試劑盒提取基因組DNA，雙蒸水溶解，經純度檢測合格后，-80℃保存。引物合成由成都合成生物科技有限公司進行。CGRP-rs155209：F：5′-GATGCGGCCGAGTGTCT-3′，R：5′-CTCCAGCGAGCGGTAGTG-3′；IFNL4-rs368234815：F：5′-TTCTGTGATTGACCCTGAGCC-3′，R：5′-CTCCGAGCATTGCCTTCC-3′；IFNL4-rs12979860：F：5′-GCGCGGAGTGCAATTCAAC-3′，R：5′-TGTACTGAACCAGGGAGCTC-3′。應用Sequenom MassAR-RAY 技術分型。(1)目的基因擴增：取適量的基因組DNA，加入96孔板。取DNA 5 ng、引物2.5 pmol、Taq聚合酶0.1 U、10 mmol/L dNTP 0.5μL。PCR擴增：93℃(15 min)，95℃(30 s)，55℃(30 s)，74℃(45 s)，循環40次，74℃(5 min)；(2)SAP反應：加堿性磷酸酶0.3 U，去除剩余的dNTP，35℃(40 min)，84℃(5 min)；(3)單堿基延伸：取5.4 pmol延伸引物、50μmol ldNTP和ddNTP混合物、加Thermosequenase DNA聚合酶0.5 U，94℃(2 min)，94℃(5 s)，55℃(5 s)，74℃(5 s)，循環35次，72℃(3 min)；(4)用樹脂脫鹽15 min，轉移至SpectroCHIP芯片，進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測。

1.5 血生化和病毒學指標檢測 使用羅氏Light Cycler 480 實時熒光定量PCR系統檢測血清HBV DNA水平；使用日本OLYMPUS公司AU400全自動生化分析儀檢測血生化指標。

1.6 統計學方法應用 SPSS 20.0統計學軟件分析，計數資料以%表示，組間采用卡方檢驗；應用Logistic回歸分析基因多態性與α-干擾素治療應答的關系，P<0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 應答組與非應答組CGRP和IFNL4基因型和基因頻率分布比較 在治療1年末，應答67例(72.8%)，未獲得完全應答25例(27.2%)；經擬合優度卡方檢驗，兩組人群CGRP基因rs155209位點及IFNL4基因rs368234815he rs12979860位點基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡定律(P>0.05)；非應答組CGRP-rs155209位點CC基因型和C基因頻率顯著高于應答組，而IFNL4-rs368234815位點TT/TT 基因型和T基因頻率顯著低于應答組(P<0.05，表1、表2)。

2.2 CGRP和IFNL4基因型與α-干擾素治療應答關聯分析 應用非條件Logistic回歸模型計算校正性別和年齡，結果顯示CGRP-rs155209位點CC基因型是影響α-干擾素治療無應答的危險基因型，OR值為1.489(95%CI：1.103～2.009)，而IFNL4-rs368234815位點TT/TT 基因型是α-干擾素治療應答的保護基因型，OR值為0.652(95%CI：0.477～0.893，表3)。

表3 CGRP和IFNL4基因型與α-干擾素治療應答關聯分析

3 討論

治療CHB的主要目的在于阻止疾病進一步發展為肝硬化，甚至肝癌，其中抑制HBV復制是延緩肝損傷和控制疾病進展的關鍵環節之一[8]。α-干擾素治療以有限療程、確切療效、停藥后復發率低等優勢得到臨床醫生和患者的認可[9]。然而，在接受α-干擾素治療的患者中，僅有部分患者對治療表現出較好的完全應答，實現生化學和病毒學應答，另外一部分患者應答效果差[10]。臨床研究發現抗病毒療效可能與多種免疫學應答基因存在關聯。

CGRP基因位于11號染色體短臂，包括6個外顯子和5個內含子[11]。CGRP是神經細胞分泌的免疫活性物質，于中樞和外周神經系統中廣泛分布，各種組織中均呈現多樣生理效應，參與炎癥過程，控制免疫應答，在炎癥發生發展過程中具有重要的作用。通過肝臟血管擴張改善肝臟血液循環，降低肝臟脂質過氧化物，預防缺血再灌注導致的肝臟損傷[12]。相關研究表明[13，14]，CGRP可減輕CHB患者肝纖維化。CGRP及其受體是治療CHB的有效靶點。本研究對CGRP基因rs155209位點基因多態性與接受α-干擾素治療的CHB患者應答進行了研究。本研究應答組rs155209位點TT和CT基因型占比顯著高于非應答組，提示CC基因型是α-干擾素治療的CHB患者無應答的危險基因型，其治療無應答風險達到TT/CT基因型患者的1.332倍。分析可能的原因，我們認為rs155209位點T→C轉換影響了CGRP的正常合成，從而影響CHB患者免疫應答修復，不利于機體清除病毒[14，15]。

IFNL4基因位于19號染色體，包括4個內含子和5個外顯子，其編碼的干擾素λ4蛋白通過激活JAK-STAT通路產生抗病毒活性[16，17]。本研究分析IFNL4基因rs368234815和rs12979860位點基因多態性與CHB患者接受α-干擾素治療應答的關系。rs368234815的二核苷酸突變體，即rs368234815(TT/△G)位于19號染色體q13.13內的IFNL3基因上游[18]。本研究應答組與未應答組rs368234815 TT/TT 型所占比例分別為92.5%和76.0%，兩組各僅有1例ΔG/ΔG型患者。本研究發現IFNL4 rs368234815位點 TT/TT 型是CHB患者接受α-干擾素治療應答的保護基因型，未應答組ΔG/ΔG和TT/ΔG基因型比例顯著高于TT/TT 型，推測攜帶IFNL4 ΔG基因者細胞分泌IFN-λ4蛋白，但分泌能力并不強，病毒感染觸發肝組織IFN-λ4蛋白弱表達，無法有效抑制病毒感染[19，20]。有研究發現，IFNL4-rs368234815位點TT/TT 型患者在接受α-干擾素治療后血清HBV DNA水平顯著低于TT/CT基因型患者，血清ALT和AST水平顯著低于TT/ΔG和ΔG/ΔG型患者，治療后生化學和病毒學應答率較高。本研究應答組與非應答組rs12979860位點基因分布無顯著性差異，rs12979860位點基因多態性不影響α-干擾素治療后的應答。IFNL4對CHB患者接受α-干擾素治療后應答的影響機制較為復雜。眾多基因參與了α-干擾素治療應答反應，而單獨基因的作用可能較小。本研究的不足之處在于未比較不同病毒載量的CHB患者CGRP和IFNL4基因型的差異，它們是否對α-干擾素治療應答產生影響，也需要進一步研究。

綜上所述，CGRP基因rs155209位點CC基因型是CHB患者接受α-干擾素治療無應答的危險基因型，而IFNL4基因rs368234815 位點TT/TT 基因型是α-干擾素治療應答的保護基因型，影響著CHB患者在α-干擾素治療后生化學和病毒學應答反應。臨床上，可針對性地篩選出可能獲得更高抗病毒治療效果的人群給予個體化的抗病毒治療，是否能提高治療效果，需要認真研究。