慢性HBV感染者外周血PNPLA3/PRKAA1基因多態性與肝硬化發生關系研究*

林秀慧，李 南，張嬌珍，符慶忠，林秀華

肝硬化屬于臨床常見的慢性肝病，由多種原因導致肝組織呈彌漫性、進行性纖維化性病變[1]。我國肝硬化病因主要為病毒性肝炎、酒精中毒和脂肪性肝病等。由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)持續感染造成肝組織炎癥，致使肝小葉遭到破壞，形成假小葉或硬化性結節[2]。據調查顯示[3]，在暴露于HBV感染的患者中，僅少數發展為肝硬化或肝癌。在慢性乙型肝炎患者中，約20%左右患者發生肝硬化，約5%患者持續感染后發展為肝癌。探討感染HBV后肝硬化發生的易感因素，為預防肝硬化的發生尋找更為有效的方法，有利于緩解疾病導致的社會經濟負擔[4]。Patatin樣磷脂酶結構域蛋白3(patatin-like phospholipase domain-containing protein 3，PNPLA3)基因位于染色體22q13.31，屬Patatin樣磷脂酶家族成員，編碼一個肝細胞膜表達的跨膜蛋白，調節脂質代謝和炎癥介質，與肝組織炎癥和肝纖維化進展有關[5]。腺苷活化蛋白激酶α1亞基(protein kinase AMP-activated catalytic subunit α1，PRKAA1)位于常染色體5p13，編碼活化AMP蛋白激酶 (adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK) 。AMPK在真核生物細胞中廣泛表達，是一種重要的能量調節器，可準確感受細胞內AMP/ATP比值變化，激活自噬，參與細胞生長增殖等一系列生物學過程[6]。本研究探討了PNPLA3/PRKAA1基因多態性與感染HBV后肝硬化發生的關系，旨在為肝硬化發生的機制研究提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年1月～2021年7月我院診治的乙型肝炎肝硬化患者101例，男65例，女36例；年齡為41～75歲，平均年齡為(52.7±6.1)歲。符合《慢性乙型肝炎防治指南》[7]和《肝纖維化中西醫結合診療指南》[8]的診斷標準。肝硬化病程為1～10年，平均為(4.7±1.3)年；肝功能Child-Pugh A級29例，B級39例，C級33例。排除標準：合并惡性腫瘤；合并心、肺、腎、腸胃等其他臟器嚴重疾病；藥物性肝損傷、酒精性肝炎；急性感染或外傷等應激狀態；重疊其他肝炎病毒感染。另選擇同期慢性無癥狀HBV攜帶者90例，男59例，女31例；年齡為40～74歲，平均年齡為(51.0±5.9)歲。入組對象簽署知情同意書，本研究獲得我院醫學倫理委員會批準通過。

1.2 血漿PNPLA3/PRKAA1基因多態性檢測 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)法檢測PNPLA3基因rs738409、rs139047、rs2294919和PRKAA1基因rs3792822、rs10036575、rs154268位點多態性。抽取靜脈血4 mL，與EDTA混合。提取樣本基因組(貝克曼AMPurea XPDNA血液基因組提取試劑盒)，用雙蒸水溶解，在檢測純度合格后，置于-80℃保存。參照美國Sequenom公司提供的序列設計引物，引物合成由成都合成生物科技有限公司進行。PNPLA3基因：rs738409位點：F：5′-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCTGCTCACTTGGAGAAAG-3′，R：5′-AGGAAACAGCTATGACCATCTGCAGGCAGGAGATGTG-3′；rs139047：F：5′-CAATGTCCACCAGCTCATCTC-3′，R：5′-CACAACACCATGCCTAGCTAAT-3′；rs2294919位點：F：5′-ACGTTGGATGTCTGTGAGTCACTTGA-3′，R：5′-ACGTTGGATGCACTACACAGCAATGC-3′。PRKAA1基因：rs3792822位點：F：5′-CTATTTAATAACCAGTTCCCTTAGTCAT -3′，R：5′-AAGTCTGAGGATTATGAGTTCTGGG-3′；rs10036575 位點：F：5′-GCAGACCCAGTAGTAGTAACCTGAAGAC-3′，R：5′-GCTACCCTGTAAGTTGCAGAATGATATA-3′；rs154268：F：5′-CTATTACTTGTGGCAAAAAGCATCC -3′，R：5′-AGTCCAAGGATCATAGGTTTCATAGAT -3′。應用Sequenom MassAR-RAY 技術分型。(1)目的基因擴增：取適量基因組DNA，加入96孔板，取DNA (5 ng)、引物(各2.5 pmol)、Taq聚合酶(0.1 U)、10 mmol/L dNTP(0.5μL)。PCR擴增：93℃、15 min，95℃、30 s，55℃、30 s，74℃、45 s，循環40次，74℃、5 min。(2)SAP反應：以0.3 U堿性磷酸酶去除剩余的dNTP，35℃、40 min，84℃，5 min。(3)單堿基延伸：延伸引物5.4 pmol、50μmol ldNTP和ddNTP混合物、Thermosequenase DNA聚合酶0.5 U，94℃、2 min，94℃、5 s，55℃、5 s，74℃、5 s，循環35次；72℃，3 min。(4)脫鹽、上機：用樹脂脫鹽15 min，轉移到SpectroCHIP芯片，行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測。

1.3 統計學方法 應用SPSS 20.0統計學軟件分析，計數資料以%表示，組間采用卡方檢驗；應用Logistic回歸分析疾病風險關聯，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝硬化組與HBV攜帶者血漿PNPLA3/PRKAA1基因型和基因頻率分布比較 經擬合優度卡方檢驗，兩組人群PNPLA3基因rs738409、rs139047、rs2294919和PRKAA1基因rs3792822、rs10036575、rs154268位點基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡定律(P>0.05)；肝硬化組PNPLA3基因rs139047、rs2294919位點和PRKAA1基因rs3792822、rs154268位點等位基因和基因型頻率與HBV攜帶者比，無顯著性差異(P>0.05)；肝硬化組PNPLA3基因rs738409位點GG基因型和等位基因G比率顯著高于HBV攜帶者，PRKAA1基因rs10036575位點CC基因型和等位基因C比率顯著高于HBV攜帶者(P<0.05，表1、表2)。

表1 肝硬化組與HBV攜帶者血漿PNPLA3基因型分布比較

表2 肝硬化與HBV攜帶者血漿PNPLA3基因頻率分布比較

2.2 PNPLA3/PRKAA1基因型與感染HBV后肝硬化發生疾病風險關聯分析 應用非條件Logistic回歸模型計算校正性別、年齡后的OR及95%CI，結果顯示PNPLA3基因rs738409位點GG基因型和PRKAA1基因rs10036575位點CC基因型是影響感染HBV后肝硬化發生的危險基因型(表3)。

表3 PNPLA3/PRKAA1基因型與感染HBV后肝硬化發生疾病風險關聯分析

3 討論

慢性HBV感染演變為肝硬化和肝癌的機制至今尚未闡明。國內外研究表明[9-11]，除病毒和環境因素之外，感染轉歸還與宿主遺傳易感因素相關。不同個體遺傳易感性對疾病發展結局造成重要的影響。

PNPLA3為跨膜蛋白，在人體主要表達于肝細胞，其次是皮膚、脂肪細胞，具脂肪酰化水解酶活性，其表達水平與飲食、體質量、胰島素水平等相關，受到肝臟和脂肪組織的綜合代謝調節[12，13]。近年來，PNPLA3基因多態性對肝病的作用引起了廣泛的研究[14]。本研究觀察了PNPLA3基因rs738409、rs139047、rs2294919位點基因多態性對HBV感染患者肝硬化發生的影響。rs738409位點編碼PNPLA3蛋白148位氨基酸。研究表明[15]，rs738409G等位基因與乙型肝炎患者脂肪變、纖維化進展等相關。本研究顯示肝硬化組PNPLA3基因rs738409位點GG基因型頻率和G等位基因頻率顯著高于HBV攜帶者，經Logistic回歸分析顯示GG基因型是導致HBV感染患者肝硬化發生的獨立危險因素。基因位點C→G轉換使異亮氨酸轉化成蛋氨酸，阻止底物結合到有催化活性的47位絲氨酸上，使其脂肪酰基水解活性喪失，導致體內甘油三酯蓄積，加速肝纖維化進程[16]。相關研究表明[17]，rs139047位點變異與HBV感染患者脂肪變相關，且其相關強度相較于rs738409位點更大。但本研究中肝硬化組rs139047位點基因分布無顯著性差異，rs139047位點基因多態性不影響肝硬化發生風險。PNPLA3對感染HBV后肝硬化的發生影響機制較為復雜，眾多基因參與其中，而單獨基因的作用可能較小。本研究肝硬化組與HBV攜帶者rs2294919位點基因型分布比較無顯著性差異，提示rs2294919位點基因多態性與肝硬化發生風險無關。

PRKAA1不僅僅是細胞內能量感受器和調節器，具有調節保守絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，能夠調節機體能量平衡和代謝應激[18]。當機體AMP/ATP升高時，發生酶磷酸化，AMPK被激活，活化后的 AMPK促進分解代謝，生成ATP，抑制蛋白質、碳水化合物、脂質合成，恢復AMP/ATP 比率，保持機體能量代謝的平衡[19，20]。本研究分析了PRKAA1基因rs3792822、rs10036575 、rs154268位點基因多態性對HBV感染患者發生肝硬化的影響。rs3792822位點存在GG、GA和AA 基因型，肝硬化組與HBV攜帶者rs3792822位點基因型分布比較無顯著差異，上述結果提示PRKAA1基因rs3792822位點基因多態性可能與 HBV相關的肝硬化易感性無關。本研究肝硬化組PNPLA3基因rs738409位點GG基因型和等位基因G比率分別為19.8%和44.6%，顯著高于HBV攜帶者的8.9%和29.4%(P<0.05)，肝硬化組PRKAA1基因rs10036575位點CC基因型和等位基因C比率分別為38.6%和63.9%，顯著高于HBV攜帶者的23.3%和45.5%(P<0.05)。經非條件Logistic回歸模型分析顯示PNPLA3基因rs738409位點GG基因型[OR為1.605(95%CI：1.150～2.239)]和PRKAA1基因rs10036575位點CC基因型[OR值為1.507((95%CI：1.097～2.070)]是影響感染HBV后肝硬化發生的危險基因型。本研究分析了PRKAA1基因rs154268位點多態性與HBV感染肝硬化發病風險的關系，結果顯示rs154268位點基因多態性與肝硬化發生風險無關。這些結果均需要擴大驗證。