聯合檢測軟骨代謝生物標志物在膝骨關節炎早期診斷中的應用

胡 楠，張 競，王 靜，王 沛，王 婧，李自成，吳田明，王亞紅，王 強，何 嵐*

(西安交通大學第一附屬醫院 1.風濕免疫科； 2.醫學影像科，陜西 西安 710061；神木市醫院 3.影像科；4.臨床檢驗科； 5.體檢中心； 6.骨科， 陜西 神木 719300)

骨關節炎 (osteoarthritis, OA)是一種累及全關節的復雜的異質性疾病，關節軟骨破壞是其最根本的病理學特征。檢測敏感有效的生物學標志物在OA早期診斷、判斷疾病進展以及新藥研發中有重要意義。ⅡA型前膠原N端前肽(procollagen ⅡA N-teminal peptide, PⅡANP)、軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)、基質金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase, MMP-3)和Ⅱ型膠原交聯C端肽(crosslinked C-telopeptide, CTX-Ⅱ)是近年來研究發現的軟骨合成和降解過程中最具代表性的新型生物標志物[1-2]。PⅡANP的表達反映了關節軟骨的主要成分Ⅱ型膠原的合成，CTX-Ⅱ和COMP的水平分別反映了Ⅱ型膠原、非膠原蛋白的降解，而MMP-3是基質金屬蛋白酶家族成員之一，可直接降解蛋白多糖和IV型膠原。聯合檢測上述4項指標可對膝OA的軟骨代謝進行全面評估。本研究選取在陜西省神木市醫院門診及住院部就診的膝OA患者，探討聯合檢測血清PⅡANP、COMP、MMP-3及尿CTX-Ⅱ在膝OA早期診斷和疾病嚴重程度評估中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：收集2017年9月至2018年8月陜西省神木市醫院門診及住院部確診的膝OA患者227例作為膝OA組(符合1995年美國風濕病學會修訂的OA分類診斷標準)，年齡40～80歲，性別不限。選取同期健康體檢者178例作為對照組，按照年齡、性別進行匹配。排除其他類型膝關節炎、嚴重的臟器損害或精神疾病、影響骨代謝的疾病、以及近4周內有糖皮質激素或其他藥物服用史者。本研究獲得西安交通大學第一附屬醫院及神木市醫院倫理委員會批準，所有受試者均知情同意。

1.1.2 主要試劑：人PⅡANP檢測試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，人MMP-3、COMP和CTX-Ⅱ檢測試劑盒(R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：常規收集受試者血清及尿液標本，保存于-80℃待測。

1.2.2 ELISA法檢測血清中PⅡANP、COMP、MMP-3以及尿液中CTX-Ⅱ水平：遵照試劑盒使用說明書操作，繪制標準曲線，在酶標儀上450 nm處測出各樣本吸光度值(A值)，根據A值在標準曲線上的位置查出各生物標志物濃度(ng/mL)。

1.2.3 臨床資料整理：收集膝OA組患者的臨床表現和一般資料，包括關節腫脹數、關節壓痛數、女性絕經情況、有無家族史、既往骨折史、激素服用史等；同時檢測患者的西安大略和麥克馬斯特大學關節炎指數(Western Ontario and McMaster Universities Arthritis Index, WOMAC)、雙膝X線正側位片、SF-36簡明健康調查問卷(short form-36 health survey, SF-36)，對膝OA受累程度和生活質量評分做總體評估。

WOMAC評分：記錄膝OA組患者關節疼痛，包括自我評價靜息痛、下蹲痛、活動痛和被動活動痛，按10 cm標尺積分，無痛為0分，最痛為10分，總指數積分用24個組成項目的積分總數來表示[3]，WOMAC指數越高表示膝OA越嚴重。根據總積分，按下列標準評估膝OA患者的輕重程度：<80分，輕度；80～120分，中度；>120分，重度。

X線分級標準：參考Kellgren-Lawrence(K-L)標準，0級為正常；1級為可疑骨贅；2級為明確骨贅和(或)關節間隙可疑狹窄；3級為中度骨贅和關節間隙明確狹窄；4級為重度骨贅、關節間隙明確狹窄和(或)關節面硬化。K-L=1級為早期膝OA，K-L=2-3級為中晚期膝OA[4]。

SF-36量表：包括生理功能(physical functioning,PF)、生理職能(role-physical, RP)、軀體疼痛(bodily pain, BP)、一般健康狀況(general health, GH)、活力(vitality, VT)、社會功能(social function-ing, SF)、情感職能(role-emotional, RE)以及精神健康(mental health, MH)共8個指標。其中PF、RP、BP和GH反映軀體健康，VT、SF、RE和MH反映精神健康。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 兩組受試者臨床特征

膝OA組共納入227例，其中女性160例(含絕經者99例，占61.9%)，男性67例；平均年齡(56.3±7.9)歲；BMI(25.53±2.97)kg/m2；WOMAC評分(34.79±38.33)分；膝關節X線K-L分級為1級166例(73.13%)，2級57例(25.11%)，3級4例(1.76%)，無4級(圖1)。對照組178例，其中女性138例(含絕經者82例，占59.4%)，男性40例；平均年齡(55.1±8.9)歲；BMI(25.40±3.14)kg/m2。

A.control group, K-L=0; B.early knee OA group, K-L=1; C.mid-late stage knee OA group, K-L=3圖1 對照組與不同階段膝OA組的膝關節X線檢測結果Fig 1 X-ray of knee joints in control group and knee OA group with different stages

2.2 兩組血清PⅡANP、COMP、MMP-3和尿CTX-Ⅱ水平比較

與對照組相比，膝OA組血清中PⅡANP水平降低，而血清中COMP、MMP-3和尿CTX-Ⅱ水平均升高(P<0.05)(表1)。

表1 兩組血清PⅡANP、COMP、MMP-3和尿CTX-Ⅱ水平比較

2.3 不同K-L分級膝OA患者血清PⅡANP、COMP、MMP-3和尿CTX-Ⅱ水平比較

早期膝OA組血清PⅡANP、COMP、MMP-3和尿CTX-Ⅱ水平與對照組無差異。中晚期膝OA組血清PⅡANP低于早期組及對照組(P<0.05)，血清COMP、MMP-3(P<0.05)和尿CTX-Ⅱ均高于早期組及對照組(表2)。

表2 健康對照組與不同K-L分級膝OA組血清PⅡANP、COMP、MMP-3和尿CTX-Ⅱ水平比較

2.4 血清PⅡANP、COMP、MMP-3和尿CTX-Ⅱ水平與膝OA患者臨床特征及生活質量評分的相關性分析

膝OA組血清PⅡANP水平與K-L分級呈反相關，血清COMP和MMP-3水平與K-L分級呈正相關，血清COMP水平還與患者年齡呈正相關(P<0.05)。血清PⅡANP水平與精神健康呈反相關(P<0.05)；COMP水平與生理功能呈反相關，與精神健康呈正相關(P<0.05)。

3 討論

在OA疾病發展的早期階段，關節局部生化因子的異常表達先于結構改變[4]。已相繼在多種體液(血清、尿液、關節液)和關節組織中(軟骨、滑膜、軟骨下骨等)檢測到大量的生物標志物，但僅有少數與OA的發生發展有關[1-2]。如何在眾多生物標志物中進行篩選并應用于臨床是目前研究的熱點[5-6]。本研究選擇了在OA發病的關鍵環節即軟骨退變中研究最多的4種生物標志物：PⅡANP、COMP、MMP-3和CTX-Ⅱ。聯合檢測它們在陜西地區膝OA患者中的表達情況及與患者臨床特征、生活質量的相關性。結果表明，膝OA患者中COMP, MMP-3和CTX-Ⅱ水平升高，PⅡANP水平降低，提示軟骨降解增加，合成減少，并隨疾病進展而進一步加劇。這一結論與既往研究[7-8]一致。

為進一步探討上述生物標志物在OA早期診斷和疾病進展中的意義，本研究將所納入的膝OA患者分為早期和中晚期兩組，結果發現，這4種生物標志物在中晚期膝OA組的表達與早期膝OA組和對照組之間均有顯著差異，而后兩組之間并未發現表達差異。這是由于OA是一種異質性很高的疾病，對早期膝OA的定義仍存在爭議，例如國外有研究以K-L=0或1級作為判斷標準[9]，中國以K-L=1或2級作為判斷標準[10]。本研究依據最新的OA分期標準[4]，將K-L=1級作為早期膝OA的納入標準。將早期OA的判斷標準統一將有助于篩選利于早期診斷的生物標志物[6]。本研究還通過SF-36量表評估膝OA患者的生活質量，發現其精神健康和軀體健康與血清PⅡANP和COMP水平相關，進一步說明上述4種生物標志物是反映膝OA疾病進展的敏感指標。

此外，血清COMP、尿CTX-Ⅱ水平會受運動、藥物、創傷、年齡、BMI等多種因素影響。本研究也發現在所有受試者中血清COMP、MMP-3水平與年齡呈正相關。因此，其穩定性和最佳檢測時間有待確定。而血清PⅡANP的表達水平與膝OA進展的相關性也有不同結論[11-12]，說明PⅡANP的水平可能反映了不同階段膝OA軟骨修復活性的不同，需要慎重評估其應用價值。