清金化痰湯治療支氣管擴張癥的作用機制*

鞏雪，曲妮妮，李金宗

1 遼寧中醫藥大學研究生學院 遼寧沈陽 110032 2 遼寧中醫藥大學附屬醫院 遼寧沈陽 110032

支氣管擴張癥為支氣管樹狀分支的不可逆性擴張[1]，是一種致殘性疾病，有統計分析其發病率逐年增高，并且可以影響任何年齡段的人。主要癥狀為咳嗽咯痰，并發持續性咳嗽和勞累性呼吸困難[2]，甚至部分病人只是反復咯血[3]。其疾病名稱來源于現代醫學研究，但其基礎理論可追溯到中國古代中醫所謂的“肺癰”“肺脹”等肺系疾病。研究表明，中醫藥對于支氣管擴張癥的干預效果顯著[4]。隨著中醫藥的日益發展，通過數據網絡在系統生物學的理論基礎上，分析生物疾病系統和中藥有效成分相關靶點，能夠更加準確合理地指導中藥在臨床治療中的運用[5]。經文獻整理研究，清金化痰湯所囊括之藥物，由黃芩與山梔子，知母，桑白皮，瓜蔞仁，貝母，麥門冬，橘紅，茯苓，桔梗，甘草11味中草藥共同配伍而成，臨床上常用于治療呼吸系統疾病中證屬痰熱蘊肺及相關癥狀綜合征。但中醫藥向來遵循整體觀念和辨證論治這個基本出發點，對方藥和疾病的關系研究較少，因而探尋清金化痰湯的與支氣管擴張癥的關系有重要價值。

資料與方法

1 清金化痰湯有效成分的篩選

于TCMSP數據庫[6]，以黃芩、梔子、川貝母、桑白皮、瓜蔞、橘紅、桔梗、知母、茯苓、甘草11種中草藥為搜索詞，通過計算機檢索方式得到中草藥相關化學成分。因麥冬在TCMSP中搜索不到，故于TCMIP數據庫[7]中檢索。而后將信息匯總，使用PubChem數據庫[8]確認化學成分，獲取相對應的2D結構及smiles號。導入SwissADME數據庫，選擇胃腸道吸收利用度GA值為“高”，并且Lipinski Veber、Ghose、Muegge、Egan 5個選項中2個以上為“是”為活性成分[9]。

2 清金化痰湯靶點預測

將所有活性化學成分2D結構或smiles號導入SwissTargetPrediction數據庫，以物種為“homosapiens”，probability＞0.1為篩選條件[10]，預測清金化痰湯活性成分作用靶點。

3 檢索已知的支氣管擴張癥靶點

于GeneCards在線數據平臺[11]，以“bronchiectasis”為關鍵詞，篩選與支氣管擴張癥聯系密切的潛在靶點。

4 篩選藥物-疾病共同靶點

利用R語言4.1.2獲得清金化痰湯與支氣管擴張癥共同靶點，于Venny 2.1在線平臺繪制韋恩圖進行可視化。

5 “復方-成分-疾病-靶點”網絡圖構建及分析

利用Cytoscape 3.8.2，展示“復方-成分-疾病-靶點”網絡中共同靶點、關鍵藥物化學成分、疾病之間的相互作用關系。

6 清金化痰湯治療支氣管擴張癥的PPI分析

使用String數據庫PPI分析功能處理共同靶點，選擇物種為“homosapiens”、置信度＞0.4，隱藏離散點，其余設置默認，獲得可以展示蛋白相互作用的PPI網絡，從而明確清金化痰湯與支氣管擴張癥共同靶點蛋白間的相互作用。運用Cytoscape 3.8.2對PPI網絡進行美化，并且篩選出核心靶點。

7 復方-疾病共同靶點的GO及KEGG富集分析

利用R語言4.1.2及org.Hs.eg.db等相關程序包，對潛在共同靶點的生物過程BP、細胞組分CC、分子功能MF這3個方面分別實現富集分析，選擇每項前10繪制可視化柱狀圖。選擇KEGG富集分析前20條進行可視化。從而探究清金化痰湯治療支氣管擴張癥的可能潛在作用機制。

8 分子對接

于PubChem數據庫[12]下載清金化痰湯核心成分的2D結構，作為配體。于PDB數據庫[13]下載核心基因的蛋白結構，作為受體。在Pymol軟件對受體蛋白去水、加氫、加電荷。配體及受體均需在AutoDock 1.5.6更改為pdbqt格式。運用Pymol獲得對接盒子xyz坐標軸參數，輸入AutoDock-Vina開始分子對接，這時計算機CPU運算得出最低結合能。PyMol獲得的受體與配體結合的復合物，導入PLIP平臺[14]進行分析，使用PyMol對最佳分子對接模式進行可視化。

結果

1 清金化痰湯活性成分及靶點篩選結果

依照上述標準，檢索并篩選清金化痰湯的化學成分，并結合已發表的相關文獻，去重后共得出清金化痰湯533種活性成分。SwissTargetPrediction數據庫提取清金化痰湯533種活性成分的作用靶點，根據Uniport ID刪除重復項，最終共得出清金化痰湯活性成分的靶點基因1140個。靶點基因與活性成分一一匹配，剔除49個未匹配成功成分，最終確定該方的活性化學成分為484個。

2 支氣管擴張癥靶點獲取結果

GeneCards數據庫中得出與支氣管擴張癥聯系密切的已知潛在靶點1348個。

3 藥物與疾病的共同靶點獲取

通過R語言得到共同靶點210個，于Venny 2.1在線平臺繪制韋恩圖。見圖1。

圖1 藥物-疾病共同靶點韋恩圖

4 “復方-成分-靶點-疾病”相互作用網絡圖

將清金化痰湯中533個活性成分與210個共同靶點導入Cytoscape 3.8.2中，隱藏游離節點（刪除114個與疾病靶點無交集的活性成分），展示“復方-成分-靶點-疾病”關系網絡。見圖2。成分度值越大，說明其在治療支氣管擴張癥中發揮作用越顯著。選取度值前10的成分，作為清金化痰湯治療支氣管擴張癥的核心成分。見表1。

圖2 “復方-成分-靶點-疾病”相互作用網絡

表1 度值排名前10的活性成分

5 清金化痰湯治療支氣管擴張癥的PPI網絡及核心靶點

依照上述標準，使用String數據庫PPI分析功能處理共同靶點，刪除1個離散節點，選擇tsv格式文件下載，并且導入Cytoscape 3.8.2構建網絡圖。見圖3。網絡圖含有209個節點和3682條邊，運用CytoNCA插件進行拓撲分析（Topological Data Analysis，TDA），根據接近中心性CC、借助度中心性DC、介度中心性BC、局部邊連通性LAC和網絡中心性NC、特征向量中心性EC這6個指標，以大于中位數為標準，進行3次計算分析，后獲得9個核心基因，分別是GAPDH、TNF、IL6、AKT1、VEGFA、IL1B、STAT3、JUN、MAPK3。見圖4、圖5。

圖3 PPI網絡圖

圖4 PPI網絡核心基因篩選流程圖

圖5 核心基因

6 GO靶點通路分析結果

GO富集分析表明清金化痰湯治療支氣管擴張癥靶點影響了2535個生物學過程，包含77個細胞組成成分，涉及了167個分子功能。BP主要有細胞間黏附的調控、白細胞-細胞粘附、白細胞與細胞粘附的調節、對細菌源分子的反應、對脂多糖的反應、單個核細胞分化、肽基-酪氨酸磷酸化、對外界刺激反應的正向調節、肽基酪氨酸修飾、T細胞活化等；CC包含膜筏、膜微域、質膜外側、水泡腔、分泌顆粒管腔、胞質小泡腔、免疫突觸、細胞頂端部分、空泡腔、質膜筏等成分；MF主要涉及跨膜受體蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、非膜跨越蛋白酪氨酸激酶活性、趨化因子結合、絲氨酸肽酶活性、絲氨酸水解酶活性、C-C趨化因子受體活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、C-C趨化因子結合等。見圖6。

圖6 GO富集分析

7 KEGG富集分析結果

KEGG富集分析得到153條通路，富集比較明顯的前20個通路包括：晚期糖基化終產物及其受體AGE-RAGE信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、Th17細胞分化、乙肝、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、流體切應力與動脈粥樣硬化、恰加斯病、人T細胞白血病病毒1型感染、缺氧誘導因子-1信號通路、前列腺癌、蛋白多糖與癌癥、NF-κB信號通路、C型凝集素受體信號通路、趨化因子信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、PD-L1在腫瘤中的表達及PD-1檢查點通路、冠狀病毒新冠肺炎、甲型流感、細胞衰老、弓形蟲病等。見圖7。

圖7 KEGG富集分析

8 分子對接分析結果

研究表明，結合能為負數時配體與受體可以自動結合，其結合能越低，對接模式越穩定[15]。見表2。結果可知，山奈酚、槲皮素、7，4'-二羥基普黃酮、芹菜素與5個靶點的結合能均較低，并且可以形成穩定氫鍵，證明清金化痰湯治療支氣管擴張癥效果頗佳。為了結果更加可視化，使用PyMol軟件對結合能小于- 9.0 KJ/mol的6種對接模式進行繪圖。見圖8。

圖8 分子對接模式圖

討論

1 藥物-疾病關系闡述

本病屬于難治性疾病，其主要癥狀為咳嗽、咯痰。在中醫學中，咳喘為肺氣氣機上逆所致。又因氣血相隨，氣機上逆而血隨之升從而可見咯血。賀夢雪等[16]從調暢肺氣對支氣管擴張癥進行論治，宗慧琪等[17]認為可以通過調理肺氣之上交氣機以達人體升降相因，所以通過梳理肺氣可以有效干預治療本病。吳夢清等[18]認為通過化痰逐瘀法可對本病有良好干預效果。

由于反復性呼吸道感染及氣道損傷，杯狀細胞、鱗狀細胞等上皮細胞組織受損，分泌粘液增多，導致痰液增多，氣道平滑肌受損從而擴張，氣道擴張導致粘液清除失敗，感染風險再度增加。所以，持續性細菌感染、免疫反應失調、纖毛清除障礙和氣道阻塞等機制相互作用和自我延續，隨著時間的推移導致肺功能一步步受損[3]。

清金化痰湯來源于明朝葉文齡所著《醫學統旨》，方中橘紅擅梳理肺氣，更有顯著的止咳化痰效果。茯苓屬利水滲濕藥，而炎癥反應為水液堆積，進而劫煉津液化為痰。氣機不利導致氣機停滯，陽氣熏蒸則阻滯而化熱，熱之極致便會化火。因而方中配合瓜蔞仁、貝母、桔梗以達到清熱滌痰之功，并以黃芩、梔子、桑白皮來泄肺中郁火。正如河間學派理論所言，“氣有余便是火”。這種“有余”是相對而言，并非絕對化，阻滯造成局部堆積依舊是相對有余。此為火證、熱證，那么火熱傷津液，所以配合麥冬知母以達到滋養肺陰的功效。又以甘草調和，以防止更多的副作用產生。金之母土也，土者脾也。甘草甘緩之性調和諸藥而控制藥效吸收利用，是“氣歸于精而味歸于形”也。全方有清熱潤肺之功，可針對支氣管擴張癥的相關癥狀進行有效干預。

2 藥物-疾病交集靶點及潛在作用機制分析

本次研究篩選獲得的山奈酚、槲皮素、7，4'-二羥基普黃酮、芹菜素均屬于類黃酮化合物，是一種廣泛的存在于我們日常的膳食類激素。氣道粘膜炎癥反應表現為粘膜下腺體增生肥厚，以及粘液分泌過多。山奈酚和槲皮素皆可通過調節NF-κB信號通路，拮抗TNF-α、IL-6等炎癥因子的分泌，同時增強抗氧化酶的表達程度，進而拮抗炎癥反應[19-21]。Cicek M[22]等通過大鼠實驗研究表明，芹菜素可以抑制氧化應激，減少炎性細胞的產生，從而達到改善肺損傷的目的。山奈酚通過阻斷支氣管上皮內質網應激反應，有效減少粘液分泌，同時抑制杯狀細胞增生[23]。來源于甘草的7，4'-二羥基黃酮，可調節NF-κB抑制MUC5AC基因表達[24]，從而減少粘液產生。正如氣行則津不停，液不阻則痰不凝，從而可以達到化痰止咳之目的。Treg細胞具有免疫抑制性，可以抑制Th17細胞，拮抗IL-17介導的炎癥反應及氣道重塑過程。而槲皮素可加強Treg細胞分化、減弱Th17細胞分化，來恢復Th17/Treg的平衡[25]，達到這一治療作用。7，4'-二羥基黃酮還可抑制嗜酸性粒細胞趨化因子產生[26]，有效降低哮喘支氣管擴張表型及支氣管肺曲霉病患者患者血清IgE水平，減輕氣道炎癥。正如《內經》所言，“正氣存內，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。上述核心成分均可減少粘液分泌，拮抗炎癥反應，改善機體免疫力，延緩氣道重塑，減輕氣道損傷。

本次研究發現9個核心靶點蛋白，分別是GAPDH、TNF、IL6、AKT1、VEGFA、IL1B、STAT3、JUN、MAPK3。GAPDH分布在人體的各個部分，參與糖酵解的能量代謝，還參與了細胞衰老凋亡、DNA修復及自噬、炎癥反應條件、免疫調節等生理過程。Takaoka Y等[27-28]研究表明，GAPDH可以顯著降低促炎細胞因子和血清趨化因子的表達，且可通過調節NAD1/NADH平衡，影響巨噬細胞吞噬功能和極化，從而改善大鼠肺損傷。Menéndez R等[29]通過對165名患者進行臨床研究發現，IL17、TNF、IL-6和IL-8水平越高，患者支氣管擴張程度越廣泛，氣道阻塞越嚴重。IL-6為炎癥反應重要因子，還參與免疫、代謝、再生和神經過程的調節，對因病毒感染和細菌感染引起的炎癥反應有重要調節作用[30]。VEGFA是血管內皮生長因子家族的一員，可以促進血管內皮恢復，改善支擴患者的咯血癥狀。同時VEGFA參與缺氧誘導因子-1信號通路，缺氧或者持續的銅綠假單胞菌感染會誘導VEGFA合成，促進生成小血管，使血管通透性升高并且滲入大量炎癥介質與細胞，加重炎癥反應[31]。STAT3可以影響Th17信號通路，生成IL-17使中性粒細胞聚集介導炎癥反應，還與因氣道損傷導致基底細胞向纖毛細胞分化的過程相關，并且參與粘液分 泌[32]。所以清金化痰湯可抑制相關炎癥反應，提高機體免疫力，減少咯血，改善肺功能以及呼吸道平滑肌氣道損傷，延緩氣道重塑過程。

GO與KEGG分析結果顯示，靶點基因主要富集在炎癥細胞間的黏附、免疫細胞分化與激活、蛋白質特異性結合以及AGE-RAGE信號通路、Th17細胞分化、缺氧誘導因子-1信號通路、NF-κB信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。AGE-RAGE信號通路與炎癥反應密不可分，RAGE是一種促炎因子，屬于免疫球蛋白超家族，其受體在肺部感染期間上調；AGE和RAGE均可以起肺細胞的氧化應激和凋亡[33]。TNF能夠抗感染、拮抗病毒復制及蛋白質合成，還可對抗細胞增殖[34]。在支擴氣道炎癥進展過程中人體自身免疫功能發揮作用，Th17細胞和CD8+T細胞、TNF-α參與其中，銅綠假單胞桿菌的細菌反應所釋放的內毒素因子以及TNF-α因子會刺激樹突狀細胞，從而能夠引起T細胞的細胞分化，這將影響Th17細胞分化通路[35]。NF-kB是重要的二聚體轉錄因子，參與炎癥、免疫調節、細胞粘附、生長信號、細胞增殖分化凋亡，在支氣管擴張癥發病機制和急慢性炎癥反應機制中起到重要作用。可見清金化痰湯可通過控制炎癥反應、減少粘液分泌、提高機體免疫力、延緩氣道重塑等方面，多成分、多靶點、多通路治療支氣管擴張癥。

通過分子對接發現，核心成分山奈酚、槲皮素、7，4'-二羥基普黃酮、芹菜素與核心蛋白GAPDH、TNF、IL6、AKT1、VEGFA的結合能均為負數。說明核心成分可以自動結合核心蛋白，并且發揮作用，通過介導激活或抑制其相關通路，達到對支氣管擴張癥的干預作用。

綜上所述，本研究闡明清金化痰湯中山奈酚在內的多個有效成分可通過介導Th17細胞分化、缺氧誘導因子-1信號通路、NF-κB信號通路、腫瘤壞死因子信號通路在內的多通路干預效應，達到多成分多靶點多通路的有效干預。對臨床治療支氣管擴張癥的作用機制具有借鑒意義，同時也為更臨床應用提供了理論支撐。但由于數據庫信息不全面、藥材成分差異等問題，結論仍待進一步實驗和臨床研究驗證。