淫羊藿作用于膝骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制研究*

金久楚，盧敏，鄺高艷，曹寅生

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長(zhǎng)沙 410208 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南長(zhǎng)沙 410000

膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee osteoarthritis；KOA）不僅在我國(guó)，甚至是全世界中老年人常見(jiàn)病、多發(fā)病，其在15歲以上人群發(fā)病率高達(dá)16%[1]。主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛，活動(dòng)障礙以及肌肉力量減弱，X線顯示：骨贅增加，關(guān)節(jié)間隙變窄等。目前西醫(yī)主要用保護(hù)軟骨，口服非甾體抗炎藥的治療方式，來(lái)緩解KOA的癥狀及進(jìn)程。需長(zhǎng)期吃藥，但并沒(méi)有根本上解決問(wèn)題，且藥物有諸多副作用[2]。因此尋找并開(kāi)發(fā)出一種治療KOA的新藥，是當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)。

根據(jù)《中國(guó)藥典》記載，淫羊藿具有補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨的功效；《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其屬于小檗科植物，性辛、甘、溫；歸肝、腎經(jīng)。《本草正義》言“稟性辛溫，專壯腎陽(yáng)”?，F(xiàn)代研究[3]表明淫羊藿具有促進(jìn)成骨細(xì)胞形成、抗衰老、增強(qiáng)免疫功能等作用，LUO等[4]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)上調(diào)AGG、PHrP基因以及下調(diào)Ihh基因的表達(dá)能夠減輕關(guān)節(jié)軟骨退變、增加關(guān)節(jié)軟骨厚度。中藥治療KOA有非常大優(yōu)勢(shì)，但因中藥作用靶點(diǎn)多，成分復(fù)雜、副作用小等特點(diǎn)，僅用現(xiàn)在的手段闡述其機(jī)制較為困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠系統(tǒng)的反應(yīng)藥物對(duì)疾病干預(yù)的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，結(jié)合生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等對(duì)藥物治療疾病靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，為臨床系統(tǒng)治療提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

材料與方法

1 淫羊藿有效成分及靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18，口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30，獲得淫羊藿有效成分及蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，然后根據(jù)文獻(xiàn)補(bǔ)充為預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)，最后借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)基因矯正及轉(zhuǎn)換。

2 KOA相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以Knee osteoarthritis為 關(guān) 鍵 詞，用Genecards、TTD、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出膝骨關(guān)節(jié)炎的主要靶點(diǎn)，去除重復(fù)值，并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)換，再借助微生信平臺(tái)（www.bioinformatics.com.cn）將“1.1”項(xiàng)與“1.2”獲得的靶點(diǎn)基因，取交集后繪制Vene圖。

3 淫羊藿成分-KOA靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)提交至String11.5數(shù)據(jù)庫(kù)，并設(shè)置生物種類為“Homo sapiens”，最高置信度＞0.7，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型[5]，并通過(guò)MCODE模塊對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得到潛在蛋白質(zhì)模塊，分析其生物學(xué)過(guò)程并對(duì)其功能描述。

4 淫羊藿成分-KOA靶點(diǎn)功能與通路富集分析

將交集基因?qū)雖etescape數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)P＜0.01，分析其生物學(xué)過(guò)程及通路并進(jìn)行富集分析，然后利用R語(yǔ)言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化

5 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

利用Cytoscape3.8.2內(nèi)置工具對(duì)有效成分及靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，包括緊密度（Closeness）、介度（Betweenness）、局部邊連通性（LAC）以及度值（Degree），來(lái)篩選核心靶點(diǎn)。

6 分子對(duì)接

基于1.5項(xiàng)得到degree排名前3的靶點(diǎn)，將3個(gè)靶點(diǎn)與淫羊藿篩選得到的4個(gè)活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，用pymol進(jìn)行可視化處理。

結(jié)果

1 淫羊藿有效成分及靶點(diǎn)獲取

淫羊藿化學(xué)成分23種，并將預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)去除重復(fù)后，獲得213個(gè)靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2 淫羊藿有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

用Cytoscape3.8.2對(duì)淫羊藿有效成分及其作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)繪制分析，共獲得226個(gè)節(jié)點(diǎn)，229條關(guān)系。可以看出對(duì)應(yīng)活性成分主要為槲皮素，其次為山奈酚、木犀草素等。如圖1（其中節(jié)點(diǎn)越大，與該點(diǎn)的連線越多，Dgree越大，則越重要）。

圖1 淫羊藿成分-靶點(diǎn)圖

3 KOA靶點(diǎn)

用Genecards、TTD、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出KOA靶點(diǎn)并去重后得到1206個(gè)靶點(diǎn)，藥物疾病交集繪制Vene圖（見(jiàn)圖2）

圖2 藥物-疾病Vene圖

表1 淫羊藿有效成分

4 淫羊藿治療KOA關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

4.1 淫羊藿治療KOA的PPI網(wǎng)絡(luò) 將疾病藥物的103個(gè)交集靶點(diǎn)提交String11.5數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置置信度＞0.7，且隱藏游離節(jié)點(diǎn)得到淫羊藿治療KOA的PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示。

圖3 交集靶點(diǎn)PPI

4.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 根據(jù)交集PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩灾?，?jīng)過(guò)篩選得到關(guān)鍵靶點(diǎn)11個(gè)，根據(jù)Degree排序分別為TNF、AKT1、IL6、JUN、TP53、IL1B、VEGFA、RELA、CASP3、MMP9、CXCL8。如圖4。

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

5 淫羊藿治療KOA通路富集分析可視化

利用R語(yǔ)言對(duì)11個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析，淫羊藿參與的主要生物學(xué)過(guò)程，有脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等，參與的通路有IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，見(jiàn)圖5。

圖5 GO分析及KEGG信號(hào)通路氣泡圖

6 分子對(duì)接

利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)一步分析，根據(jù)成分-靶點(diǎn)圖篩選得到的4個(gè)活性成分分別為槲皮素、山茶酚、木犀草素、8-異戊烯醇。根據(jù)PPI結(jié)果，取degree值前3的靶基因分別為TNF、AKT1、IL6，對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示活性成分與靶基因的結(jié)合能在-8.9kcal/mol與-4.48kcal/mol之間，結(jié)合能的絕對(duì)值越高，說(shuō)明淫羊藿活性成分與KOA的核心基因的親和力越高。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，8-異戊烯醇與靶基因的結(jié)合能力較強(qiáng)。并用pymol進(jìn)行可視化，如圖6。

表2 淫羊藿活性成分與KOA靶基因?qū)釉u(píng)分表

圖6 8-異戊烯醇與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接圖

討論

膝骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)屬于“膝痹”“骨痹”范疇，本病主要因外感風(fēng)寒濕之邪，邪盛入里，氣血虧虛，肝腎虧損，筋骨失養(yǎng)，不榮則痛；《類證治裁》云：諸痹……良由營(yíng)衛(wèi)先虛，腠理不密，風(fēng)寒濕乘虛內(nèi)襲……故在骨則重而不舉，在血?jiǎng)t凝而不流，在筋則屈而不伸。此病多因患者年老體弱，加之腠理不固，風(fēng)寒濕三氣內(nèi)襲而為病。正虛血瘀是其基本病機(jī)，后面鄺高艷等人[6]又將“毒、瘀”視為KOA的基本病機(jī)，認(rèn)為久病必瘀，瘀而化內(nèi)毒，虛瘀毒互結(jié)，加之外感風(fēng)寒濕三邪，合而為痹?！稄埵厢t(yī)通·卷五諸痛門》曰：膝痛無(wú)有不因肝腎學(xué)者。說(shuō)明此病的發(fā)生與肝腎兩臟的關(guān)系及其密切。

通過(guò)查閱文獻(xiàn)，對(duì)于淫羊藿有效成分治療KOA研究，槲皮素可降低THF-α、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)、影響相關(guān)信號(hào)通路以及抑制ECM酶的降解來(lái)治療KOA[7-9]。山奈酚[10]為黃酮醇類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒的功能。能通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白酶相關(guān)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和抑制P38信號(hào)通路來(lái)降低炎癥反應(yīng)[11]，也有研究表明其可通過(guò)降低IL-1β來(lái)抑制軟骨細(xì)胞促炎介質(zhì)的表達(dá)[12]。木犀草素能夠降低NO、PGE2的生成和COX-2等的表達(dá)，來(lái)防治關(guān)節(jié)軟骨的破壞和Ⅱ型膠原的表達(dá)[13]。也有研究表明，木犀草素能與MMP1和MMP3結(jié)合，下調(diào)其表達(dá)量來(lái)緩解KOA的炎癥反應(yīng)[14]，也能保護(hù)軟骨細(xì)胞，減輕軟骨變性[15]。

TNF、AKT1、IL6是治療KOA的主要靶點(diǎn)，TNF是一種促炎細(xì)胞因子，其能促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），從而導(dǎo)致軟骨被破壞，并通過(guò)NF-kB途徑抑制軟骨生成[16]。AKT1被活化后能上調(diào)CyclinD1，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞凋亡[17]。有研究表明[18]AKT信號(hào)通路能夠有效減緩KOA的進(jìn)程。IL6與TNF都是促炎因子，與TNF不同的是，IL6可以增強(qiáng)TNF在關(guān)節(jié)病中的作用，且還能通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄激活等途徑誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分解代謝，加重KOA的形成[19]。所以淫羊藿可能是通過(guò)調(diào)節(jié)這些核心靶點(diǎn)來(lái)達(dá)到治療KOA的作用的。

研究結(jié)果表明淫羊藿是通過(guò)不同的治療靶點(diǎn)作用不同的信號(hào)通路來(lái)治療KOA的，體現(xiàn)了淫羊藿多靶點(diǎn)、多通路聯(lián)合的作用特點(diǎn)?？蔀榕R床挖掘開(kāi)發(fā)治療KOA的特效藥提供科學(xué)依據(jù)，也為淫羊藿的療效評(píng)價(jià)指標(biāo)提供參考。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)靶點(diǎn)具有一定的局限性，只能通過(guò)大量的數(shù)據(jù)計(jì)算進(jìn)行篩選，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)來(lái)佐證該研究。