防己茯苓湯治療射血分數保留型心力衰竭的作用機制

周健，邵正斌，戚先偉，付玉軒，陳虹，徐海娟，湯忠富，李舒

1 安徽中醫藥大學 安徽合肥 230038 2 安徽中醫藥大學第一附屬醫院 安徽合肥 230031 3 安徽中醫藥科學院心血管病研究所 安徽合肥 230031

流行病學調查顯示，我國住院的31356例慢性心力衰竭患者中[1]，射血分數保留型心力衰竭（Heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）患 者約占43.0%，我國HFpEF患者在心衰患者中占比較高，目前，西醫在治療HFpEF主要采用利尿劑、醛固酮受體拮抗劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑等藥物緩解癥狀，在降低HFpEF的發病率和死亡率方面尚缺乏有效的手段[2]。

HFpEF對應中醫心衰，中醫對于心衰的治療可追溯到兩千多年前，《內經》中“夫不得臥，臥則喘者，是水氣之客也”是對于心衰癥狀及病機最早的闡述[3]。《金匱要略》中“皮水為病，四肢腫，水氣在皮膚中，四肢聶聶動者，防已茯苓湯主之”，防已茯苓湯有滲濕利水、健脾和胃、寧心安神的作用，由防己、黃芪、桂枝、茯苓、甘草等五味藥物組成。2016年《慢性心力衰竭中西醫結合診療專家共識》[4]中建議使用防己茯苓湯治療心衰以通陽利水。本研究以防己茯苓湯為研究對象，利用網絡藥理學及分子對接多成分、多靶點、多通路的研究思路探究該藥治療HFpEF的物質基礎以及作用機制，為后續的研究提供依據。

資料與方法

1 活性成分的挖掘與篩選

利 用TCMSP數 據 庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）進行文獻檢索，收集防己茯苓湯各個藥物的成分。并選擇符合口服生物利用度（OB）值≥30%和藥物相似性（DL）值≥0.18的成分，作為其活性成分，刪除重復數據，并整理記錄。

2 活性成分-靶點網絡構建

通過TCMSP平臺進行檢索，將整理好的活性成分查找對應的活性靶點蛋白，利用數據庫 UniProt（https：//www.uniprot.org）規范化翻譯配對靶點名稱，將物種選擇規定為人類（HUMAN），得到對應的基因靶點。

3 HFpEF疾病的靶點收集

在GeneCards（https：//www.genecards.org）、Dis-GeNET（https：//www.disgenet.org）、中 以“Heart failure with preserved ejection fraction”為關鍵詞進行檢索，獲得HFpEF的疾病靶點，去重整理后獲得HFpEF疾病的靶點。

4 活性成分對應疾病靶基因確定

將上述得到的成分-基因靶點、疾病-基因靶點，導入 Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），得到藥物和疾病共同靶點韋恩圖，得到并整理防己茯苓湯有效活性成分調控HFpEF靶基因的網絡節點。

5 蛋白質互作網絡

使用 STRING 軟件（https：//string-db.org）對藥物和疾病二者的交集靶點進行蛋白互作（PPI）網絡構建，設置信度 score≥0.400 并隱藏游離節點，獲取 TSV 數據，導入至 Cytoscape 3.9.1 軟件進行可視化分析，并利用插件Network Analyzer分析網絡節點Degree值，篩選出節點 Degree 值排名前20的節點作為核心靶點。

6 交集基因 GO 和 KEGG 富集分析

將藥物和疾病的交集靶點導入 Metascape 平臺（http：//metascape.org/gp/index.html），設置 P＜0.01，限定物種為“Homo sapiens”，并對其進行GO和KEGG富集分析，導出相關數據，將數據進行處理后，使用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn）進行可視化處理。

7 防己茯苓湯主要活性成分與核心靶點分子對接

利用TCMSP數據庫下載防己茯苓湯主要活性成分的mol2格式，使用AutoDock Tools 1.5.7處理防己茯苓湯主要活性成分后保存為“pdbqt”格式，作為分子對接配體；在 PBD 蛋白數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下載核心靶點蛋白結構，運用 PyMol 軟件去除受體蛋白的水分子及原小分子配體，用 AutoDock Tools 1.5.7添加非極性氫與電荷后保存為“pdbqt”格式，作為分子對接受體。運用 AutoDock Vina進行分子對接，導入配體和受體，設置合適的對接盒子，生成相應的的構象，去除未生成氫鍵的構象，選擇能量最低的構象作為最佳結合構象，保存為 PDB 格式后用 Pymol 3將防己茯苓湯關鍵活性成分與核心靶點對接結果進行可視化處理。

防己茯苓湯有效成分篩選及靶點預測

通過 TCMSP平臺檢索，整理出防己茯苓湯活性成分，得到活性成分為：防己3個，茯苓15個，黃芪20個，桂枝7個，甘草92個，統計重復后整理為128個。將128個活性成分，通過 UniProt規范化翻譯配對靶點名稱，將物種選擇規定為人類（HUMAN），排除無對應靶點及無人類基因靶點后，去重后得到全方候選靶點227個見表1。

表1 防己茯苓湯活性成分-靶點預測結果

1 防己茯苓湯及HFpEF靶基因網絡節點

以“Heart failure with preserved ejection fraction”為檢索詞，在數據庫GeneCards以及DisGeNET進行檢索，排除重復值，獲得HFpEF基因 1377個，將上述得到的活性成分基因，疾病基因，導入 Venny2.1，整理得到防己茯苓湯有效成分與HFpEF靶基因的交集靶點為123個見圖 1。確定防己茯苓湯有效成分調控HFpEF靶基因的網絡節點。

圖1 防己茯苓湯與HFpEF Venn圖

2 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖分析

使用 Cytoscape 3.9.1 對 123 個交集靶點進行“藥物-活性成分-靶點”網絡圖的繪制，見圖 2。利用插件Network Analyzer分析網絡節點Degree值，得到338個節點，1778條邊，節點的顏色的明暗和大小依據 degree 值而設定，degree 值越大，節點的顏色越深，面積越大。

圖2 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖

圖中藍色菱形的圖標代表交集靶點，綠色圓形圖標代表中藥，其中FJ、FL、HQ、GZ、GC分別是防己、茯苓、黃芪、桂枝、甘草的簡寫，外周六邊形圖標代表防己茯 苓湯的活性成分，其中A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、B1、C1成分代表中藥的共有成分，見表2。

表2 防己茯苓湯藥物共有成分表

3 防己茯苓湯與HFpEF交集靶點PPI 網絡圖分析

將 123個“交集靶點”導入STRING 數據庫，獲取 PPI 網絡圖及相關的數據文件，將數據初篩后導入 Cytoscape3.9.1 進行直觀的拓撲分析，得到 122 個節點，2400 條邊，節點的大小和顏色的明暗依據 degree 值而設定，degree 值越大，節點的顏色越深，面積越大；邊線條的粗細由 Combined Score 值決定，Combined Score 越高連線越粗，見圖3。將 degree 值排名前20的蛋白篩選出來，見圖4，防己茯苓湯可能主要通過這些靶點治療 HFpEF，認為這些靶點是防己茯苓湯治療HFpEF的核心靶點。

圖3 防己茯苓湯治療HFpEF靶點PPI網絡

圖4 PPI網絡中degree值排名前20的靶點

4 防己茯苓湯與HFpEF交集靶點GO 和 KEGG 富集分析

運用Metascape數據平臺對防己茯苓湯和HFpEF的交集靶點進行GO和KEGG富集分析。運用微生信平臺進行可視化處理后得到如下KEGG分析圖和GO分析圖，見圖5、圖6。可見交集靶點參與的生物學過程（BP）主要包括細胞對脂質的反應、對激素的反應、細胞對有機環狀化合物的反應、細胞遷移的積極調節、對氧氣水平的響應、調節細胞粘附、血液循環、細胞群增殖的負調節、調節凋亡信號通路等。防己茯苓湯與HFpEF交集靶點主要分子功能（MF）富集在RNA聚合酶II特異性DNA結合、細胞因子受體結合、腎上腺素能受體活性、轉錄因子結合、蛋白質均質二聚活性、蛋白酶結合等。“交集靶點”細胞組分（CC）富集在膜筏、轉錄調節因子復合物、受體復合物、囊泡腔、細胞外基質、膜的側面、早期內體、內質網腔、核信封、細胞質的核周區域等。KEGG 富集分析進一步解釋了防己茯苓湯治療HFpEF的潛在機制，通過分析發現參與的通路主要有PI3K-Akt信號通路、血脂與動脈粥樣硬化通路、HIF-1信號通路、鈣離子信號通路、P53信號通路等通路，這些通路可能是防己茯苓湯治療HFpEF的關鍵通路。此外還有癌癥通路、糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路等通路，表明防己茯苓湯可能參與相關疾病的調節。

圖5 防己茯苓湯和 HFpEF“交集靶點”的 KEGG 富集分析

圖6 防己茯苓湯和HFpEF“交集靶點”的GO富集分析

5 防己茯苓湯主要活性成分與核心靶點分子對接

通過分子對接技術對網絡藥理學結果進一步分析，篩選網絡中度值較高的有效成分和靶點進行對接，對防己茯苓湯中有效成分治療HFpEF的能力進行預測打分。根據圖 2分析結果，在選擇度值的情況下同時考慮每個藥物，故篩選來自防己的MOL002341（Hesperetin，橙 皮 素），來 自 茯 苓 的 MOL000296（hederagenin，常春藤素），來自黃芪的MOL000098（quercetin，槲皮素），來自桂枝的MOL000358（betasitosterol，β-谷 甾 醇），來 自 甘 草 的MOL000422（kaempferol，山柰酚），這5個成分作為對接配體。根據圖 4 分析結果，選取AKT1、IL6、TNF、TP53、CASP3度值排名前5的核心靶點作為對接受體，用結合能（Affinity ）來評估成分與靶點的結合能力，結合能＜0 表明可以自由結合，結合能越低表明配體與受體之間的親和力越大，二者發生相互作用的可能性就越高。由于數據較多，故展示排名前 20 位的對接結果，見表3。利用 Pymol 軟件對部分分子對接結果進行可視化處理，見圖 7，其中藍色為蛋白受體，綠色為小分子配體，黃色虛線為配體與受體之間形成的氫鍵，表示配體與受體之間的結合較穩定。分子對接結果顯示成分與靶點能夠較好結合。

圖7 Vina 部分分子對接模式圖

表3 防己茯苓湯關鍵活性成分與核心靶點分子對接結果（前 20 名）

討論

1 防己茯苓湯治療HFpEF藥效成分分析

網絡藥理學研究結果顯示，防己茯苓湯的有效活性成分為128個，發揮治療HFpEF的關鍵成分有槲皮素、山柰酚、橙皮素等。

槲皮素是一種植物衍生代謝物，屬于黃酮類化合物，具有抗炎、保護心臟、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬和抗凋亡活性等作用[5]。研究表明，槲皮素可以通過減輕炎癥反應、延緩心室重構、降低心肌細胞損傷，以此來改善慢性心力衰竭大鼠的心功能[6-7]。

山柰酚是一種天然黃酮醇類黃酮，具有抗炎、保護心臟功能、預防癌癥、保護顱神經等作用[8]。Feng等人[9]指出，山奈酚通過對ASK1/MAPK信號通路的抑制和氧化應激的調節防止心臟肥大，從而保護小鼠心臟和H9c2細胞免受病理性氧化應激。

橙皮素及其衍生物在治療心力衰竭和心臟重塑，心肌缺血和梗死以及高血壓方面具有療效[10]。研究表明[11]，橙皮素可以通過抑制小鼠中NF-κB信號通路的激活，從而降低小鼠炎癥細胞因子水平及心臟纖維化的可能。本研究結果與上述研究報道相符，說明防己茯苓湯在治療HFpEF具有多成分共同作用的特點。

2 防己茯苓湯治療HFpEF關鍵靶點分析

依據網絡藥理學及分子對接結果，發現 AKT1、IL6、TNF、TP53、CASP3等靶點可能是防己茯苓湯治療HFpEF的關鍵靶點。

AKT1是AKT的一種亞型。AKT[12]是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是參與多種細胞過程的信號轉導途徑中的關鍵酶。研究表明[13]，AKT1能增加細胞大小，減少細胞凋亡，并被認為對心力衰竭有益。AKT激活心臟保護作用，促凋亡蛋白功能的阻斷和保護性信號通路的啟動。AKT信號對心肌細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、及心肌成纖維細胞存活具有重要意義[14]。在起搏引起的心力衰竭中，AKT活性下降也與細胞凋亡增加有關[15]。

IL-6是先天免疫的關鍵細胞因子，它具有一套廣泛的生理功能，與宿主防御，免疫細胞調節，增殖和分化有關[16]。IL-6通過與IL-6受體結合，形成的IL-6受體復合物作用于心肌細胞中的GP130信號轉導受體，產生負性肌力作用以及細胞毒性作用，通過改變心肌纖維的排列結構，發生心肌重塑，從而誘發心力衰竭[17]。

TNF是一種多效性細胞因子，是炎癥中的重要細胞因子。對哺乳動物心肌細胞的實驗研究表明，TNF 發揮直接的肌力負作用，降低心肌細胞的活力，增強心肌纖維化和心室肥大。TNF的過度表達導致對β腎上腺素能刺激和心臟重塑的反應降低[18]。此外TNF的慢性刺激會增加其他促炎細胞因子的形成，例如IL-6和IL-1，它們也參與慢性心力衰竭的發病機制[19]。

3 防己茯苓湯治療HFpEF作用機制分析

對防己茯苓湯與HFpEF交集靶點進行富集分析發現，它們可能參與調控了PI3K-Akt信號通路、血脂與動脈粥樣硬化通路、HIF-1信號通路、鈣離子信號通路、P53信號通路等通路。以及對脂質的反應、對氧氣水平的響應、血液循環、細胞群增殖的負調節、調節凋亡信號等生物過程。

PI3K-AKt信號通路在心血管疾病、腫瘤、代謝紊亂、腎臟疾病中發揮著重要的作用。研究表明[20]，PI3K-AKT信號通路可能通過通路參與血管形成、調節代謝、激活炎癥、影響鈣離子循環蛋白、調控細胞凋亡自噬等方式作用于心力衰竭。PI3K-Akt信號通路通過調控細胞存活、凋亡、生長、心肌收縮，甚至相關基因的轉錄，參與調節心肌纖維化的發生、發展和病理形成[21]。

HIF-1信號通路明是心臟代謝發育變化的關鍵調節通路之一。調節范圍包括基因轉錄、蛋白質穩定性和蛋白質相互作用，對缺氧環境的反應范圍從多樣化的細胞調節到系統性回應[22]。心力衰竭、動脈粥樣硬化等心血管疾病中均有組織缺氧的表現，調控 HIF-1 信號通路可減輕機體缺氧狀態。

p53信號通路主要為轉錄因子發揮作用，并誘導多種分子誘導凋亡，阻止細胞生長、抑制血管生成、DNA修復功能、調節衰老等。p53被認為是適應各種有害刺激的關鍵分子，包括缺氧、氧化應激、感染等。研究表明[23]，p53信號通路在心衰、動脈硬化、細胞衰老、新陳代謝中起著關鍵作用。

綜上，本研究采用網絡藥理學，發現防己茯苓湯可能通過槲皮素、山柰酚、橙皮素等關鍵成分，作用于AKT1、IL-6、TNF、TP53、CASP3等靶點，通過參與血管形成、調控細胞凋亡自噬、調節代謝、影響鈣離子循環蛋白等作用，從而治療HFpEF。本研究可為防己茯苓湯治療HFpEF及其他相關疾病的研究及臨床應用提供一定的參考依據。