“黃芪-牛膝”藥對治療糖尿病足的作用機制研究*

鄭佳，吳鵬，王一兵

1 山東中醫藥大學 山東濟南 250014 2 濟南市組織工程皮膚再生與創面修復臨床醫學研究中心 山東濟南 250014

糖尿病足（diabetic foot，DF）是因糖尿病引起下肢神經系統疾病及不同程度的血管病變，隨病情的進展在足部產生潰瘍，伴或不伴感染[1]，是糖尿病一種嚴重的并發癥，影響了患者的生活質量。隨著時代發展和生活水平的提高，糖尿病率越來越高，人們對并發癥的關注也隨之增加，但是目前尚未有徹底治愈的方法；隨著足部潰瘍患者治療周期長，給患者帶來了一定的經濟負擔，而中醫藥在治療是具有安全在、有效、經濟的特點，已被很多醫家接受。中醫學認為DF屬“脫疽”“腳疽”范疇。

藥物配對使用是中藥常用的應用形式之一，“黃芪-牛膝”藥對來源于治療腳疽的經典方顧步湯。黃芪藥性甘，微寒，歸脾、肺經，具有行滯通痹、生津養血、斂瘡生肌、利水消腫、脫毒排膿等功效。黃芪是滋補良藥，被稱之為“瘡家圣藥”。研究發現，黃芪能夠控制創面的感染，促進肉芽組織的形成[2-3]，縮短創面愈合的時間，作用機理可能與促進成纖維細胞的增殖、膠原合成、抑制細胞凋亡和延緩細胞衰老相關[4-7]。牛膝藥性苦、甘、酸、平，歸肝、腎經，具有利尿、補肝腎、強筋骨、逐瘀通經的功效。最初記錄于《神農本草經》，謂其“主寒濕痿痹，四肢拘攣，膝痛不可屈伸，逐血氣，傷熱火爛，墮胎。久服輕身耐老。”經現代藥理學研究證明，牛膝可通過阻止IL-1β誘導的IκBα降解和磷酸化表現出抗炎作用[8]，有可能與調控TGF-β1/Smad通路相關[9]，牛膝多糖能夠增強體液免疫功能，能夠抑制細胞凋亡和抗氧化作用[10-12]，由此可見“黃芪-牛膝”在治療DF中的重要作用。目前對黃芪和牛膝的研究已有不少深入研究，但在治療DF方面的靶點尚研究不足，而中藥在人體多組分、多靶點、多途徑等特點與網絡藥理學系統分析的方式相契合[13]，故本研究通過運用網絡藥理學和分子對接技術的方法，預測這兩種中藥治療DF的靶點及通路，探究其可能的作用機制，為今后深入研究提供理論基礎和依據。

材料與方法

1 黃芪-牛膝成分及作用靶點獲取

在TCMSP數據庫平臺（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、HERB（drug.ac.cn）分別以黃芪和牛膝為關鍵詞檢索，下載它們的化學成分及作用靶點，并以口服生物利用度（OB） ≥ 30%、類藥性（DL） ≥ 0.18為條件，篩選出活性成分及潛在靶點；利用 UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/uploadlists）和R語言軟件將靶點的基因名稱標準化。

2 糖尿病足靶點的檢索

以“diabetic foot” 為關鍵詞分別在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https：//www.omim.org/）及Pharmgkb（https：//www.pharmgkb.org）這四個數據庫檢索獲取疾病靶點，同時運用 R 語言軟件將所得靶點進行整合，剔除重復靶點。

3 藥物與糖尿病足共同靶點篩選

將之前獲取的藥物作用靶點與DF的作用靶點運用 R 語言軟件繪制藥物與DF的共同靶點并繪制韋恩圖。

4 共同靶點蛋白互作網絡構建及可視化

將藥物與DF的共同靶點導入SRTING數據庫（https：//string-db.org）中，設置選擇“multiple proteins”“homo sapiens”，設置隱藏游離點（hide discon-nected nodes in the network），在 minimum required interaction score中選擇highest confidence（0.400），更新下載蛋白互作網絡（PPI）高清圖和TSV文件。將下載的TSV格式文件導入Cytoscape3.8.2軟件進行相關參數設置后得到 “藥物成分-糖尿病足靶點”的調控網絡圖。

5 GO功能及KEGG通路富集分析

利用R語言軟件將共同靶點的symbol轉換為基因ID；并對共同靶點進行GO 與KEGG 富集分析。GO分析可獲得共同靶點的生物學過程（BP）、細胞組分（CC）及分子功能（MF），并將富集度高的以條形圖呈現；KEGG分析獲得靶點富集程度較高的信號通路，并以條形圖呈現。

6 成分-靶點分子對接驗證

為了探究結果的可靠性，對藥物成分和靶點蛋白進行分子對接驗證。在Pub Chem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取成分的小分子配體2D結構，然后將其用ChemOffice 軟件制作成3D結構；從 PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org）中下載靶點蛋白基因的3D結構，用PyMOL 2.5.1軟件去除水分子和小分子配體后，再使用Auto Dock 軟件將得到的活性成分及核心蛋白基因轉換為pdbqt 格式，確定活性口袋，用腳本進行對接。將結果用PyMol 2.5.1軟件進行可視化處理。

結果

1 黃芪-牛膝成分及作用靶點檢索結果

在TCMSP 及HERB數據庫獲得符合條件的有效成分共48個，其中黃芪有效活性成分25個，牛膝有效活性成分23個，刪除重復成分后共46個，見表1；藥物成分作用靶點779個，經 UniProt 注釋并去重后剩余 207個藥物作用潛在靶點。

表1 黃芪-牛膝藥用成分

2 糖尿病足疾病靶點檢索結果

在分別在GeneCards數據庫獲得416個靶點，TTD獲得17個靶點，Pharmgkb獲得24個靶點，OMIM數據庫獲得95個靶點，經 R 語言軟件刪除重復靶點后剩余 486個。

3 藥物與疾病共同靶點篩選結果

運用R 語言軟件篩選得到藥物與DF共同靶點有56個，見圖1A。

圖1 黃芪-牛膝作用于糖尿病足靶點篩選

4 蛋白互作網絡（PPI）的構建及可視化分析

為了進一步了解蛋白見間的相互作用關系，將“黃芪-牛膝”與DF的共同靶點導入STRING數據庫中進行分析得到PPI網絡關系圖，節點代表靶點蛋白，邊代表靶點蛋白的關系，線條越多表示該蛋白越重要，如圖1B所示。關系圖中共有56個節點，782條邊，平均節點度為27.9。將所得TSV格式文件利用Cytoscape軟件進行可視化分析，相關設置后繪制出“藥物成分-糖尿病足靶點”網絡關系圖，如圖2。Degree值越大則圖形越大，在其種發揮的作用也越重要，可見藥物成分種Degree值最大的是MOL000098（quercetin）和MOL000422（kaempferol），靶點基因種Degree值較大的是PTGS2、AR、NOS2、ADRB2、ESR1。

圖2 藥物成分-靶點網絡圖

5 藥物與DF的GO功能及KEGG通路富集分析

將藥物與DF的共同靶點利用R語言進行GO分析后總共得到2201個功能，其中BP有2017條，CC有35條，MF有149條，并將在BP、CC、MF富集度最高的前20個功能繪制成條形圖（見圖3A），圖形顏色越紅表示基因在該功能富集度越高；R語言進行KEGG通路富集分析后可得到141條相關通路，將富集度最高的30條通路繪制成條形圖（見圖3B）。顏色由紅到藍，顏色越紅代表該通路富集的基因率越高，校正后的P值也越小。

圖3 交集靶點富集分析 （A）GO富集分析，包括生物進程，細胞組分，分子功能 （B）KEGG通路分析

6 核心成分與關鍵靶點的分子對接

從“藥物成分-糖尿病足靶點”網絡圖中選擇基因靶點degree值最高關鍵靶點（PTGS2、AR、NOS2）分別與主要化學成分（槲皮素、山奈酚）進行分子對接，將對接結果可視化得到如圖4。對接最低結合能如表2所示。

表2 核心成分與關鍵靶點的分子對接

圖4 分子對接模型示意圖

討論

DF是糖尿病嚴重的并發癥之一，糖尿病人體內異常的代謝環境也使得其患病率顯著提高，創面的難以愈合對患者的生活質量和心理都產生不良的影響。中醫藥黃芪和牛膝在治療創面方面均有研究報道其效果明確，值得進一步的研究，且中醫藥經濟實惠，在長期治療時給患者帶來的經濟負擔較少。

本研究在TCMSP數據庫篩選出“黃芪-牛膝”的46個活性成分，在疾病相關數據庫得到DF靶點486個，映射后最終得到22個活性成分作用于56個DF靶點。從“藥物成分-糖尿病足靶點”網絡關系圖中可知槲皮素、山柰酚、黃芩素等是“黃芪-牛膝”治療糖尿病足種發揮重要作用的化學物。槲皮素是一種類黃酮化合物，現已有研究發現其具有抗炎，抗氧化等多種藥理活性[14-16]。槲皮素[17]可以促進成纖維細胞的增殖和遷移能力，通過抑制TNFα、IL1β、IL6等炎癥因子增加小鼠生長因子的表達來有效促進創面的愈合。炎癥細胞因子的產生與巨噬細胞M1和M2表型的極化密切相關，Fu等人[18]發現槲皮素可以通過調節巨噬細胞極化從M1轉向M2表型來抑制炎癥反應，促進糖尿病傷口的愈合。此外，在一項實驗研究中發現[19]嵌入槲皮素和油酸的納米水凝膠處理與透明質酸治療相比，顯著減少了傷口的愈合時間，而且不會發生不良藥物反應。另外山奈酚是一種黃酮類化合物，具有抗炎，抗菌、抗氧化、鎮痛等多種藥理活性[20-21]。Liu等人[22]發現山奈酚可以減少活性氧（ROS）的產生，抑制p38MAPK和JNK的磷酸化降低氧化應激和炎癥反應。提示“黃芪-牛膝”治療糖尿病足是多種化合物通過多種途徑發揮作用的結果。

PPI網 絡 圖 顯 示PTGS2、AR、NOS2、ADRB2、ESR1等是治療糖尿病足的作用靶點。前列腺素內過氧化物合成酶2（PTGS2），是非甾體類藥物的作用靶點之一，主要參與機體炎癥反應[23-24]，并在促進細胞增殖和遷移等方面具有重要作用[25]。雄激素受體（AR）屬于核受體超家族中的類固醇受體，在多種組織中均有表達，并且各個組織中表達水平不同，甚至同一組織，也會隨其發育階段而有所變化，病理狀態下，表達水平也會發生改變[26-27]。炎癥刺激可誘導一氧化氮合酶2（NOS2）的表達并產生大量的NO[28]，NO和過氧亞硝酸鹽的增多導致細胞結構的氧化損傷[29]，有研究表明NO在抗氧化中起著至關重要的作用，并有助于應對超氧化物的殺細胞作用[30]。

GO功能富集分析顯示“黃芪-牛膝”藥對治療DF的生物學過程主要富集在細胞對化學應激的反應（cellular response to chemical stress）、小分子代謝過程的調控（regulation of small molecule metabolic process）、抗 氧 化 反 應（response to oxidative stress）、對營養水平的反應（response to nutrient levels）等；細胞組分主要富集在膜筏（membrane raft）、膜微結構域（membrane microdomain）、膜 區（membrane region）、質膜的外側（external side of plasma membrane）等；分子功能則富集在受體配體活動（receptor ligand activity）、信號受體激活因子活性（signaling receptor activator activity）、RNA聚合酶II-特異性DNA -結合轉錄因子結合（RNA polymeraseII-specific DNA-binding transcription factor binding）、DNA結合轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）等。表明“黃芪-牛膝”可以通過參與多種生物學過程發揮其治療DF的作用。KEGG通路富集分析顯示“黃芪-牛膝”治療糖尿病足通路主要有流體剪切應力和動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis），其次是脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、AGE - RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）和IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）等。相關研究發現AGE-RAGE 信號通路與多種細胞因子，氧化應激及血管等諸多方面有關[31]。HIF-1已被證實在傷口愈合和重塑過程中有著重要作用[32]，HIF-1可以增加細胞增殖、促進血管和膠原的形成等作用促進創面的愈合[33-35]。

文獻研究表明成分與蛋白結合自由能低于-5 kcal/mol則可認為二者結合穩定[36]，結合能越小代表成分與靶點蛋白結合越好。而本研究分子對接結果顯示結合能均低于-7kcal/mol，說明關鍵藥物成分與核心蛋白有很好的結合作用。其中黃色虛線表示氫鍵，標明了化合物中該氫鍵與化合物的位置。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學和分子對接技術手段探究了“黃芪-牛膝”治療DF可能的作用機制，篩選出槲皮素、山奈酚等22個有效活性成分，這些活性成分可能通過PTGS2、AR、NOS2等重要靶點，參與AGE-RAGE、HIF-1等多條信號通路發揮抗炎，抗氧化應激等作用治療DF，體現了其在治療時多種有效成分通過多靶點在多通路協同作用的特點，同時利用分子對接技術驗證了主要成分與蛋白較高的結合活性，為中醫藥“黃芪-牛膝”治療糖尿病足提供了數據支持，為臨床應用提供理論基礎，為今后深入研究提供參考資料。但本研究仍面臨需要克服的困難，如由于現有的相關數據庫的尚不完整，有效成分篩選的篩選則不完全，無法揭示其完整的藥理作用，同時數據庫中的內容常為當前熱點問題，使得研究的結果往往集中于熱點的靶點和通路，其機制的研究就存在一定的偏頗。而未來對于網絡藥理學的研究還需要進一步規范數據，運用更多的實驗研究加以驗證。