9株野生根瘤菌的分離鑒定及60Co耐受·吸附性研究

伏 毅，劉綿學，王 艷，高 鵬，黃 敏

(四川省原子能研究院，輻照保藏四川省重點實驗室，四川成都 610101)

隨著核工業的發展，核安全事故也嚴重威脅著人類的健康，2021年日本宣布向太平洋排放核廢水更是對全人類的生命健康造成威脅[1]。核技術應用帶來的核污染如控制不利，將長期威脅到人類的健康與安全。放射性核素60Co廣泛應用于農業、工業、放射醫療等行業，也發生過一些核安全事故[2-3]，核電站泄露產生的放射性污染中也存在60Co[4]，造成放射性污染，如20世紀90年代，在山西省忻州由于轉運廢棄放射源時遺漏60Co廢料而造成重大核污染事故，導致多人死亡，因此，針對60Co的放射性污染處理技術開發有著迫切的現實需求。

目前，用于核污染水體、土壤修復方法主要有物理法、化學法等[5-6]，然而這些技術需要復雜設備條件、巨額的花費。而生物修復技術具有效率高、安全性能好、費用低、易于管理與操作等優點，在修復核素污染水體、土壤中的作用越來越重要。國內外的研究表明利用微生物、植物吸附污染水體、土壤中的重金屬、核素是一種有效且價廉的修復污染的方式[7]，加上利用生物技術對植物、微生物的目的性改造，使生物修復技術具有巨大的社會、經濟價值[8]。

根瘤菌是生活在土壤中的革蘭氏陰性桿狀細菌，在合適的條件下，根瘤菌能侵染豆科植物，通過類菌體形式與豆科植物建立共生關系，使根的局部膨大形成根瘤，為植物提供氮源，同時植物供給根瘤菌以礦物養料和能源[9]。長期研究中發現根瘤菌的活動與鈷(Co)存在緊密的聯系，根瘤菌在其代謝活動中可合成鈷胺素——一種含Co的維生素B類大分子物質；Co是根瘤菌與植物共生的必需元素，Dilworth等[10]報道缺Co導致根瘤短小，而恢復Co元素供應后，側根上Co富集濃度增加。Riley等[11]報道在羽扇豆中由于土壤缺Co，造成根瘤菌浸染的種子成瘤率降為30%，未浸染種子的成瘤率降為13%。由于根瘤菌與Co元素的特殊關系，使利用根瘤菌修復Co污染水體、土壤具有易于回收的優勢。目前，利用根瘤菌與植物共生修復銅[12-13]、鎘[14-15]、多環芳烴[16]等污染土壤均有報道，但是用于放射性核素60Co的報道較少。該研究分離純化采自多個地區的野生植物根瘤菌，對其進行理化性質分析和分子鑒定，并對純化菌株進行模擬60Co耐受及吸附能力研究，探討根瘤菌用于放射性60Co污染水體、土壤修復的可能性。

1 材料與方法

1.1 菌株采集、分離與純化采摘自四川成都菜地、海南石碌銅礦區等地的大豆、紫花苜蓿、豬屎豆等植物根系(表1)，按照高亞梅等[17]的方法分離純化根瘤菌。

表1 供試菌株來源

1.2 菌株形態特征觀察按照張俊杰等[18]的方法進行革蘭氏染色，于光學顯微鏡下觀察菌體形態、大小；在YMA 平板上培養72 h觀察菌落形態特征。

1.3 生理生化特征的測定依據《伯杰細菌鑒定手冊》[19]，用HB8540(青島海博)無氮培養基測定根瘤菌固氮類型，用0.5%BTB YMA液體培養基測定根瘤菌產酸堿性。

1.4 分子鑒定菌體培養和根瘤菌總DNA提取參考谷峻等[20]的方法進行。使用多位點序列分析方法對分離到的根瘤菌進行分子鑒定。設計檢測引物位點為16S-IGS、nifH、recA，合成引物分別為16S-IGS(上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′，下游引物5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′)、nifH(上游引物5′- TAC GGN AAR GGS GGN ATC GGC AA -3′，下游引物5′- AGCATGTCYTCSAGYTCNTCCA -3′)、recA(上游引物5′- TTC GGC AAG GGM TCG RTS ATG -3′，下游引物5′- ACA TSA CRC CGA TCT TCA TGC -3′)。

PCR反應總體積為50 μL，其中包括TaKaRa EXTaq酶0.25 μL、10×PCR緩沖液5 μL、MgCl24 μL、引物各2 μL、模板DNA 2 μL。PCR 程序：①16S-IGS，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 90 s，35個循環，72 ℃ 5 min，10 ℃10 min；②nifH，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環，72 ℃ 5 min，10 ℃10 min；③recA，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環，72 ℃ 5 min，10 ℃10 min。PCR產物由上海英駿生物技術有限公司進行測序，使用blastn在線搜索高度相似序列，使用Mega 5.0軟件進行多序列比對，確定測試菌株的進化分類。

1.5 抗逆性試驗以YMA培養基為基本培養基。內源抗生素抗性試驗設置Amp/Kan/Str的終濃度為5、25、50、100 μg/L；耐鹽試驗設NaCl終濃度為0、0.1%、0.5%、1.0%、5.0%、10.0%共6個梯度；酸堿試驗設置pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0共11個梯度。分別接種后置于28 ℃恒溫培養。接種后于第7天觀察結果。以上試驗均設空白對照，3次重復，無菌操作。

1.6 根瘤菌輻照耐受能力測定YMA培養基中28 ℃搖菌48 h，6 000 r/min 5 min離心沉淀菌體，使用0.1 mol/L PBS緩沖液重懸細菌，重復3次后備用。使用60Co輻射源裝置對根瘤菌株進行照射處理，輻照劑量為1、3、5、8、10 kGy；使用電子加速器對根瘤菌菌株進行照射處理，輻照劑量為50、100、150、200、250 Gy；使用平板稀釋法計算致死率；以上試驗均設無輻照空白對照，3次重復，無菌操作。

1.7 根瘤菌59Co耐受能力檢測配制含59Co濃度為0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L的YMA培養基。接種后于第7天觀察結果。以上試驗均設空白對照，3次重復，無菌操作。

1.8 根瘤菌59Co吸附能力檢測將根瘤菌接種于50 mL YMA培養基中，28 ℃搖菌48 h，加入59CoCl2，使培養基中59Co終濃度為0.1 mmol/L，繼續搖菌0.5 h，12 000 r/min 5 min離心，收集上清，使用二甲酚橙-鈷標準曲線分光光度法檢測上清中殘留59Co的濃度，并計算根瘤菌對59Co的清除率。

使用Graphpad Prism 5軟件分析59CoCl2溶液濃度隨時間變化的趨勢，構建吸附動力學吸附反應回歸方程，分析其吸附過程的反應特征。

2 結果與分析

2.1 根瘤菌細胞和菌落形態經革蘭氏染色觀察，9株菌株均為短桿狀(圖1D)，革蘭氏染色陰性，無芽孢，能運動。在YMA 培養基上培養3 d 可形成直徑0.8～0.9 cm菌落，菌落為圓形，表面凸起光滑，半透明，邊緣整齊(圖1C)。

注：A.大豆根及根瘤；B.大豆根瘤；C.YMA-CR平板上的大豆根瘤菌菌落形態；D.根瘤菌細胞形態，鏡檢倍數為40×100倍

2.2 根瘤菌生理生化特征反應1#、2#、6#、7#菌株在HB8540(青島海博)無氮培養基中生長緩慢，屬于共生固氮菌；其余菌株屬于聯合固氮菌。0.5%BTB YMA液體培養基培養3～7 d測試，1#、2#、6#、7#菌株培養基呈藍色，產堿，為慢生菌株，生長世代時間分別為9.87、10.26、29.50、15.60 h；3#、4#、5#、8#、9#菌株培養基均呈黃色，產酸，為快生菌株，生長世代時間分別為7.63、4.82、5.03、6.68、11.41 h。

2.3 根瘤菌分子生物學鑒定recA基因是編碼細菌DNA重組蛋白的α亞基，與細菌修復系統行使功能相關[21]。nifH基因是根瘤菌共生固氮關鍵的基因，主要編碼根瘤菌固氮酶的組分Ⅱ中的鐵蛋白[22]。綜合16S-IGS、recA、nifH基因序列比對結果(圖2)，對9株根瘤菌進行分類，1#、2#、6#菌株為Bradyrhizobiumjaponicum，3#、8#菌株為Sinorhizobiummeliloti，4#、5#菌株為Rhizobiumsp.，7#菌株為Bradyrhizobiumyuanmingense，9#菌株為Rhizobiumhuautlense。

圖2 16S-IGS(A)、recA(B)、nifH(C)基因相似序列比對結果

2.4 根瘤菌的抗逆性測試

2.4.1pH適應性。經分析，1#～9#菌株在弱酸性到弱堿性(pH 3～8)培養基中均能生長；3#、4#、8#、9#菌株在pH 10的培養基中均能生長，4#菌株生長較差；3#、8#、9#菌株在pH 11的培養基中均能生長；9#菌株在pH 12～13的培養基中均能生長(表2)。

表2 根瘤菌菌株的pH適應性

2.4.2鹽耐受性。從表3可以看出，1#、2#、6#、7#菌株在0.5% NaCl培養基中均不能生長；3#、4#、5#、8#菌株在1.0% NaCl培養基中能生長，但是所有菌株在5.0% NaCl培養基中均不能生長。

表3 根瘤菌菌株的鹽耐受性

2.4.3天然抗生素抗性。具有抗生素抗性的根瘤菌能夠更好地在具有抗生素的環境中生存[23]，也有利于實驗室對根瘤菌的篩選。通過對根瘤菌抗生素抗性的測定，結果發現，4#、5#、7#、8#、9#菌株具有天然Amp抗性，其中，4#、5#、7#、8#菌株最大能耐受100 μg/L的Amp，9#菌株最大能耐受50 μg/L的Amp(表4)；所有菌株均不具有Kan、Str抗性。

表4 根瘤菌菌株的天然抗生素抗性

2.5 根瘤菌輻照耐受能力檢測60Co輻照處理所有根瘤菌菌株，在1、3、5、8、10 kGy輻照劑量處理后，生長7 d均無菌落出現，說明1 kGy的60Co γ射線就能殺滅所有供試根瘤菌菌株。

利用電子加速器進行低劑量的輻照處理，驗證50～250 Gy輻照劑量處理后各根瘤菌菌株的生長情況。從圖3可以看出，在100 Gy或以上的劑量照射后，均可使所有供試菌株無法生存；在50 Gy的電子束照射后，9#菌株的致死率最低。試驗結果說明，9株根瘤菌均對高劑量的輻照處理敏感，僅在低放射性的環境中能夠存活。

圖3 電子加速器輻照處理后根瘤菌的致死率

2.6 根瘤菌59Co耐受能力檢測從表5可以看出，5#菌株在0.1～0.5 mmol/L59Co培養基中均能生長，7#菌株僅能在0.1 mmol/L59Co培養基中生長，其他菌株在0.1～0.2 mmol/L59Co培養基中均能生長。

表5 根瘤菌59Co耐受性檢測

2.7 根瘤菌59Co吸附能力檢測如圖4所示，通過測定培養根瘤菌后的培養基上清液中59Co含量，根瘤菌上清液中的殘留59Co含量均顯著降低，其中9#菌株上清液中殘余量最低，為加入菌株前的85%，即菌株對培養基中59Co的清除率為15%。1#～4#、6#、7#菌株上清液中59Co的殘余量均高于95%，圖中未列出，以對59Co耐受能力較好的5#菌株為代表。

圖4 培養基中59Co殘余百分比

3 結論

9#菌株具有耐強堿環境的生理特性，在pH≥13的環境中仍然能夠存活；9個菌株對鹽耐受性都不強，在5.0% NaCl環境中均不能生長；4#、5#、7#、8#、9#菌株具有天然Amp抗性；9個菌株均對60Co產生的γ射線敏感，1 kGy輻照劑量即可殺死所有菌株；在100 Gy電子束輻照也能殺滅菌株，說明篩選到的9個根瘤菌菌株只能在低放射性的環境中存活。相較于其他菌株，5#菌株對59Co具有較強的耐受性，在濃度達到0.5 mmol/L的培養環境中仍能生長；9#菌株對培養基中59Co具有較強的清除能力，經1.5 h培養清除率達到15%。5#菌株和9#菌株的發現對利用微生物修復59Co污染的水體、土壤具有一定的潛力。