蛋白激酶B通路、乙酰肝素酶、NADPH氧化酶在心肌缺血再灌注損傷中的作用及相互關系的研究進展

尹惠陽，藺雪峰，韓軒茂

(1. 內蒙古科技大學包頭醫學院 研究生學院，內蒙古 包頭 014060；2. 內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院 心內一科，內蒙古 包頭 014010)

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是因血管部分或全部閉塞引起組織缺血缺氧，血液再通后，分子氧突然向缺血組織再分布并進一步損害缺血組織及周圍組織的一種獨特損傷反應[1]。IRI的病理生理機制是目前研究的熱點[2]。常見的急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的一種嚴重類型，其發病率和死亡率均較高。AMI最有效的治療方法是通過溶栓、血管成形術和冠狀動脈搭橋術等手段使缺血心肌血運重建，但是心肌IRI可引起諸多并發癥。研究發現，在缺血/再灌注過程中，蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)及NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)不同程度地表達，并且相互作用，可能引起細胞凋亡，導致IRI[3-5]。

1 Akt、HPSE、Nox在IRI中的作用

1.1Akt在IRI中的作用 Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，已知3種亞型，分別為Akt1，Akt2及Akt3。Akt1和Akt3廣泛表達，而Akt2在胰島素敏感組織如棕色脂肪、骨骼肌和肝臟中表達，它們在心血管系統中發揮多種作用[6]。Akt作為多種細胞功能的調節劑，主要通過組成PI3K/Akt信號通路來發揮作用[7]。PI3K/Akt信號通路涉及多種生理病理過程，參與細胞生長、代謝及腫瘤增殖侵襲等過程[8]。既往研究表明，細胞凋亡在IRI中起重要作用[9]。PI3K/Akt信號通路通過調節相關分子的表達來調節細胞凋亡，在細胞凋亡、血管生成、血管舒張、新陳代謝等方面起重要作用[10]。

研究表明，在IRI過程中Akt作用于不同的下游因子來發揮不同生物學效應。Sulaiman等[11]實驗證明，激活PI3K/Akt/GSK-3 RISK通路可以減輕心肌細胞的線粒體功能障礙，減輕心肌IRI。缺血/再灌注時，血管平滑肌細胞分泌重組人成纖維細胞生長因子，激活PI3K/Akt通路，Akt通過激活雷帕霉素復合物1(mammalian target of rapamycin C1，mTORC1)，引起參與細胞增殖的各種mTORC1底物磷酸化，調節細胞生長和增殖。mTORC1的活化使缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白水平增加，進一步增加血管內皮生長因子的分泌，導致血管形成和內皮細胞遷移[12]。同時，Akt抑制叉頭框蛋白O3a和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)等下游因子[13]，使線粒體通透性轉換孔減少，穩定缺血/再灌注細胞中的線粒體膜電位，增加平滑肌細胞的增殖[14-15]。Akt還可以磷酸化內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，eNOS在由生長因子和血管緊張素誘導的血管生成和血管通透性中起主要作用，其產生的NO具有血管舒張、保護心臟的作用[16]。

1.2HPSE在IRI中的作用 HPSE是唯一一種具有降解硫酸乙酰肝素(heparan sulfide，HS)能力的內-β-葡萄糖醛酸酶，廣泛存在于多種細胞的細胞表面和細胞外基質中。HPSE酶促活性為催化切割HS蛋白的聚糖側鏈，有助于細胞外基質和基底膜的重塑并促進與HS連接的生長因子、細胞因子、酶等分子的釋放。HPSE還通過與跨膜蛋白的相互作用來觸發不同信號通路，發揮其非酶促作用[17]。病理情況下，如缺血/再灌注、腫瘤進展和轉移、炎癥和纖維化，HPSE過表達[18]。

Masola等[19]研究發現，腎臟IRI時，腎小管和腎小球的HPSE增加，誘導腎小管細胞凋亡和巨噬細胞向M1極化，促進單核細胞活化，同時HPSE過表達觸發HS降解發揮其酶促活性，并調節多配體蛋白聚糖1(syndecan-1，SDC1)表達，HPSE與SDC1相互作用，誘導堿性成纖維細胞生長因子通過PI3K/Akt通路引起部分近端腎小管上皮細胞向成肌纖維細胞的上皮-間質轉化。HPSE調節腎小管上皮細胞促炎因子表達，引起炎癥反應，造成組織損傷，誘導腎小管細胞死亡，促進纖維化[20]。

1.3Nox在IRI中的作用 活性氧(reactive oxygen species，ROS)可調節多種氧化還原依賴性信號通路。而Nox是ROS生成所必需的酶，是細胞分化、生長、增殖及各種機制的重要調節劑[21]。在哺乳動物中，目前已知有7種Nox同工型，分別為Nox 1～5、Duox 1和Duox 2[22]。其中，Nox2和Nox4在干細胞和心肌細胞中大量表達，是心臟缺血/再灌注過程中產生ROS的主要來源，在心臟損傷和重塑的發展中起著至關重要的作用[23-24]。Nox的主要作用是產生ROS參與氧化應激[25]。ROS的產生和抗氧化防御系統處于動態平衡，低水平的ROS可以啟動細胞內信號轉導，調節細胞功能，對心臟起保護作用[26]。但心血管危險因素造成ROS產生過多，超過抗氧化防御系統的調節，將會導致氧化應激，進一步引起內皮細胞活化和巨噬細胞浸潤，抑制內皮細胞產生NO，促進動脈粥樣硬化，參與細胞增殖、遷移及分化，進一步加重血管疾病[27-28]。

Nox亞型在介導缺血再灌注后的氧化應激和心肌損傷中起重要作用，抑制Nox活性可有效防止ROS過度產生。研究表明，Nox2和Nox4在缺血/再灌注時表達上調，產生超氧陰離子，在酶作用下轉化為H2O2[29]。超氧化物通過陰離子通道孔隙，導致NO降解、過氧亞硝酸鹽形成和蛋白質酪氨酸硝化等。H2O2通過與過氧化物酶反應，使酪氨酸磷酸酶等失活，引起細胞毒性。Nox在缺血和再灌注過程中均有參與，HIF-1α促進Nox的活化，而氧化應激進一步增加HIF-1α的產生，形成正反饋，加重損傷。此外，再灌注后細胞還釋放磷脂酶A2、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β和血管緊張素II等介質來激活Nox產生ROS[30]。ROS可能導致炎細胞積聚，產生細胞因子，進一步促進Nox過表達，從而引起心臟、腦、胃腸等多種器官的再灌注損傷[5]。

2 Akt、HPSE、Nox在IRI中的相互作用

2.1HPSE介導PI3K/Akt通路 多項研究表明，HPSE可激活多種信號傳導途徑，調節多種細胞功能，其中HPSE誘導PI3K/Akt通路并增強Akt磷酸化最為常見。Ben-Zaken等[31]研究表明，HPSE對Akt/PKB的激活是由脂質筏介導的。脂質筏可能通過與整合素αVβ3和α5β1結合，并將其激活。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)家族包括FAK和富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶2(proline-rich tyrosine kinase 2，PYK2)。整合素招募FAK和PYK2，誘導FAK在Tyr-397處及PYK2在Tyr-402處的自我磷酸化[32]。活化的FAK、PYK2與PI3K的p85亞基結合，使p85亞基活化，p85亞基激活PI3K的p110α亞基，引起PI3K磷酸化，導致磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2)磷酸化為3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3, 4, 5-trisphosphate，PIP3)，PI3K與Ras結合結構域(RAS)相互作用促進了Akt磷酸化。Thr-308位點和Ser-473位點是Akt磷酸化最重要的位點。Riaz等[33]研究發現，HPSE介導Akt的Ser-473位點磷酸化，PIP3激活mTORC2并結合Akt，導致Akt的Thr-308位點部分激活，mTORC2引起Akt的Ser-473位點完全磷酸化，造成Akt磷酸化。

2.2Akt與Nox的相互促進作用 PI3K/Akt通路的下游因子約有100多種蛋白質，作用于不同的下游因子引發不同的生物學效應。Nox是產生ROS引發氧化應激的主要物質，Nox與Akt之間相互作用，但是它們之間確切的上下游關系存在爭議。

已有多項研究表明，Akt促進Nox激活和ROS產生[34-40]。Nakanishi等[34]研究發現，PI3K/Akt和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活處于同一路徑，位于細胞膜去極化的下游，但在Nox激活的上游。PKC抑制劑與PI3K抑制劑作用相當，兩種抑制劑的共同作用并不強于單獨使用，說明PI3K和PKC存在于相同的通路內。Cai等[35]研究提示，PKC-δ可能作為Akt的上游起作用，參與Nox合成的調節。在非吞噬細胞中，PI3K/Akt通路激活后，Akt通過磷酸化S304和S328位點上的p47-phox，引起p47-phox磷酸化，通過將p47-phox和Rac-1從胞質轉移到細胞膜上來組裝膜Nox復合物，從而激活Nox[36-37]。Nox活化后，Nox通過與分子氧和NADPH的氧化還原反應產生超氧陰離子，將其還原為H2O2，Nox相關的胞質蛋白與完整的膜亞基結合形成功能性酶，從而產生ROS[38]。Nox組裝和ROS過度產生除引起氧化應激導致細胞死亡外，還會引起大量鈣內流和血管收縮，導致血壓升壓[39-40]。

2.3Nox促進PI3K/Akt通路激活 Nox和ROS主要通過誘導10號染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)降解、抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)以及調節蛋白質酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)來激活PI3K/Akt通路。脂質可通過上調PTEN導致PIP3被磷酸化還原為PIP2，從而抑制PI3K/Akt信號通路，而過度的氧化應激可以抑制負調控因子PTEN的活性來激活PI3K/Akt信號傳導[34]。Nox導致氧化應激和H2O2產生增多，暴露于H2O2環境中的PTEN會失活，從而激活PI3K/Akt信號通路[41]。在缺氧H9C2細胞和原代心肌細胞中，Nox4促進Akt磷酸化；PP2A通過絲氨酸473和蘇氨酸308位點對Akt進行去磷酸化[42]。而Nox4可導致Src激酶激活，氧化半胱氨酸殘基上的PP2A，并下調PP2A活性，抑制Akt通路的負向調控，從而導致Akt活性增強[43]。ROS還可通過PTP調節PI3K/Akt信號傳導[36]。另外，還有研究表明，Nox4還可通過激活Akt/mTOR和NFκB信號通路來誘導心肌肥大及纖維化，抑制Nox4可能是治療心臟重塑的潛在方法[44]。

3 小結與展望

綜上所述，Akt作為多種細胞功能的調節劑，受到多種上游因子及下游因子的調控，作用于不同因子，顯現出不同的作用。在IRI中，Akt對損傷的調節也是多方面的。Akt主要通過增強mTORC1、eNOS、GSK3β等下游因子來起到保護心臟作用。同時，還可以通過激活Nox引起氧化應激，造成細胞損傷。現有研究提示，HPSE、Akt、Nox均參與IRI，并且相互影響。由于HPSE與Nox擁有共同的信號通路(PI3K/Akt通路)，我們推測PI3K/Akt可能是HPSE和Nox4間的中介物質，因此HPSE對Nox的調控仍值得關注。HPSE與Nox之間的相互作用及Akt是否起到核心中介作用有待進一步深入研究。心肌IRI中，HPSE是否通過PI3K/Akt信號通路，調控缺血/再灌注心肌細胞Nox的表達，誘導心肌細胞凋亡的作用機制的相關研究十分匱乏，需要進一步研究發掘。